DB32∕T 4056-2021 优良食味半糯粳稻品质

ICS65.020.20CCSB22DB32江苏省地方标准DB32/T4056—2021优良食味半糯粳稻品质Qualityofsemi-glutinousjaponicaricewithgoodtaste2021-06-03发布2021-07-03实施江苏省市场监督管理局发布DB32/T4056-2021I前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由江苏省农业科学院提出。本文件由江苏省农作物标准化技术委员会归口。本文件起草单位：江苏省农业科学院、扬州大学、江南大学、江苏里下河地区农业科学研究所、江苏省种子管理站、江苏省农业技术推广总站。本文件主要起草人：王才林、张亚东、张洪程、刘巧泉、王莉、李爱宏、何金龙、管永祥、朱镇、宋锦花、魏海燕、赵春芳、魏晓东、陈涛、赵庆勇、赵凌、姚姝、周丽慧、路凯、梁文化。DB32/T4056-20211优良食味半糯粳稻品质1范围本文件规定了优良食味半糯粳稻品质的术语和定义、质量要求、检验方法、检验规则及判定规则。本文件适用于半糯粳稻品种的选育、鉴定、评价和推广，适用于商品半糯粳稻的收购、加工和销售。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB1350稻谷GB/T1354大米GB/T5490粮食检验一般规则GB/T5491粮食、油料检验扦样、分样法GB/T15682粮油检验稻谷、大米蒸煮食用品质感官评价方法GB/T17891—2017优质稻谷GB/T21719稻谷整精米率检验法GB/T22294粮油检验大米胶稠度的测定NY/T83米质测定方法NY/T593食用稻品种品质NY/T2639稻米直链淀粉的测定分光光度法3术语和定义GB1350、GB/T1354、GB/T17891和NY/T593界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1半糯粳稻semi-glutinousjaponicarice稻米直链淀粉含量在2%~13%之间，含有低直链淀粉含量的Wx等位基因（如Wxmp、Wxmq、Wxmw等）的粳稻。3.2优良食味半糯粳稻semi-glutinousjaponicaricewithgoodtaste品质达到本标准4规定的质量要求、品质等级三级及以上的半糯粳稻。DB32/T4056-202123.3鉴别标记identificationmolecularmarker用于鉴别低直链淀粉含量基因（如Wxmp、Wxmq、Wxmw等）、经PCR反应扩增出的特征性条带或序列，详见附录A。4质量要求4.1基本质量要求杂质含量、水分含量、黄粒米含量、谷外糙米含量、色泽气味等基本质量指标应符合GB1350粳稻谷要求，不完善粒含量应≤3%，异品种率应≤2%。4.2定等质量指标在符合GB1350的基础上，优良食味半糯粳稻的定等质量指标见表1。表1优良食味半糯粳稻品质等级注1：等级评定须在相同的水分条件下进行。5检验方法5.1低直链淀粉含量基因Wxmp、Wxmq、Wxmw的检验按照附录A执行。5.2不完善粒含量检验：按GB/T17891—2017，6.5执行。5.3异品种率检验：按照GB/T17891—2017，附录B执行。5.4整精米率检验：按照GB/T21719执行。5.5透明度检验：按照NY/T83执行。5.6直链淀粉（干基）含量检验：按照NY/T2639执行。5.7胶稠度检验：按照GB/T22294执行。5.8食味值检验：按照GB/T15682执行。指标等级一二三整精米率/%≥67.061.055.0透明度/级≤123直链淀粉（干基）含量/%8.0~13.0胶稠度/mm≥908070食味值/分≥908580DB32/T4056-202136检验规则6.1扦样、分样按照GB/T5491执行。6.2检验的一般规则按照GB/T5490执行。7判定规则7.1类型判定含有低直链淀粉含量基因（如Wxmp、Wxmq、Wxmw等）的，判定为半糯粳稻。7.2等级判定达到本标准4.1规定的基本质量要求，表1中5项定级指标全部达到该等级要求的，则判定为该等级半糯粳稻。5项定级指标中有1项达不到该等级质量要求的，逐级降至符合的等级；不符合最低等级指标要求的，为非等级产品。基本质量要求有1项及以上不符合的，为非等级产品。7.3等级分类品质等级达三级及以上的判定为优良食味半糯粳稻，低于三级的判定为普通半糯粳稻。DB32/T4056-20211附录A（规范性）低直链淀粉含量基因Wxmp、Wxmq和Wxmw分子标记检测方法A.1原理低直链淀粉含量突变基因Wxmp、Wxmq和Wxmw是在Wxb基因的第4、第5和第6外显子发生了单碱基突变（图A.1）。仅在第4外显子第53位碱基发生G-A突变的为Wxmp基因，同时在第4外显子第53位碱基发生G-A突变和第5外显子第52位碱基发生T-C突变的为Wxmq基因，仅在第6外显子第62位碱基发生A/C突变的为Wxmw基因。利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术可针对第4和第6外显子的变异位点进行分子标记检测；利用成对引物可针对第5外显子的变异位点进行PCR扩增和序列分析，根据突变位点的有无和类型，来判断是否含有突变基因Wxmp、Wxmq和Wxmw。图A.1Wx基因的结构及Wxmp、Wxmq和Wxmp基因突变位点示意图A.2仪器设备高速冷冻离心机、PCR扩增仪、超纯水系统、组织研磨仪、琼脂糖凝胶电泳系统及制胶附件、凝胶成像系统、微量可调移液器（2uL、10uL、100uL、1000uL）。A.3试剂与溶液A.3.1DNA提取试剂十六烷基三甲基溴化铵、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氢氧化钠、氯化钠。A.3.2PCR扩增试剂DNA、引物、dNTP、Taq酶、10×PCR缓冲液、超纯水。A.3.3电泳试剂DB32/T4056-202126×上样缓冲液、DNA分子量标准、1×TAE电泳缓冲液、核酸染料。A.3.4DNA回收试剂凝胶回收试剂盒。A.4DNA提取稻谷出苗后在三叶期按单株取水稻叶片，提取基因组DNA。DNA提取方法及试剂配制方法按NT/T1433执行。A.5分子标记序列A.5.1用于鉴定Wxmq或Wxmp的分子标记序列利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术可对Wxmq或Wxmp第4外显子第53位碱基发生的G-A突变进行分子标记鉴定，四引物序列为：正向外引物（Wxmq/Wxmp-O-F）序列为5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC-3'，反向外引物（Wxmq/Wxmp-O-R）序列为5'-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3'，正向内引物（Wxmq/Wxmp-I-F）序列为5'-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3'，反向内引物（Wxmq/Wxmp-I-R）序列为5'-GTCGATGAACACACGGTCGACTCAAT-3'。利用成对引物PCR扩增法可对Wxmq第5外显子第52位碱基发生的T-C突变进行分子标记鉴定，成对引物序列为：正向引物（Wxmq-F）序列为5'-GGCTTCACGCAACGGCGCTACAAATAG-3'，反向引物（Wxmq-R）序列为5'-CCATTCGCCTGCAAAGAACACAAGAAC-3'。A.5.2用于鉴定Wxmw的分子标记序列利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术可对Wxmw第6外显子第62位碱基发生的A/C突变进行分子标记鉴定，四引物序列为：正向外引物（Wxmw-O-F）序列为5'-GCTTAGCTTCCACTGGTGATTTCA-3'，反向外引物（Wxmw-O-R）序列为5'-GTAGATGCCATTGGGCTGGTAGT-3'，正向内引物（Wxmw-I-F）序列为5'-AACAACCCATACTTCAAAGGAACATC-3'，反向内引物（Wxmw-I-R）序列为5'-TCTTGAGATCAATTGTAACTCCCCAT-3'。A.6PCR反应体系20μLPCR反应体系，包括2.0μL样品DNA(10ng/μL)，2.0μL引物等摩尔混合液(4pmol/μL/每条)，2.0μL10×PCR缓冲液(含MgCl2)，0.4μLdNTP(2.5mmol/L)，0.5μLTaq酶(5U/μL)，13.1μL超纯水。DB32/T4056-20213A.7PCR反应程序A.7.1Wxmq或Wxmp第4外显子分子标记的PCR反应程序95℃下预变性3min；95℃下变性30s，65℃退火30s，72℃下延伸1min，共33个循环；72℃延伸5min，4℃保存。反应在PCR扩增仪（热循环仪）上进行。A.7.2Wxmq第5外显子分子标记的PCR反应程序95℃下预变性3min；95℃下变性30s，58℃退火30s，72℃下延伸2min，共33个循环；72℃延伸5min，4℃保存。反应在PCR扩增仪（热循环仪）上进行。A.7.3Wxmw分子标记的PCR反应程序95℃下预变性3min；95℃下变性30s，55℃退火30s，72℃下延伸1min，共33个循环；72℃延伸5min，4℃保存。反应在PCR扩增仪（热循环仪）上进行。A.8PCR产物检测A.8.1琼脂糖凝胶制备在三角瓶中将琼脂糖与1×TAE缓冲液按1.5%质量比混合，煮沸至琼脂糖颗粒完全溶解，按1：10000（体积比）加入核酸染料，摇匀后倒入制胶槽托盘板上，插上样品梳，冷却凝固后拔出样品梳，备用。A.8.2上样样品制备在20uL的PCR扩增产物中加入4uL6×上样缓冲液，混匀。A.8.3电泳将琼脂糖凝胶放入电泳槽，加入1×TAE缓冲液至刚没过凝胶，每个样品孔加入5uL上样样品，以20V/cm的电压进行电泳，电泳20min。A.8.4凝胶成像将电泳后的琼脂糖凝胶放于凝胶成像系统的紫外光源下进行PCR扩增产物观察，拍照备用。用成对引物Wxmq-F/R扩增得到的PCR条带需割胶回收、回收试剂盒纯化后，送测序公司进行序列分析。A.9结果分析A.9.1分子标记检测结果分析利用四引物Wxmq/Wxmp-O-F/O-R/I-F/I-R分子标记可扩增得到三种类型的DNA特征条带（图A.2），扩增得到439bp和292bpDNA条带的样品，证明含第4外显子突变位点；扩增得到439bp和200bpDNA条带的样品，证明不含此突变位点，同时扩增得到439bp、292bp和200bpDNA条带的样品，证明此突变位点为杂合位点。利用成对引物Wxmq-F/R分别作为测序引物，可获得DNA条带的核苷酸序列（图A.3），如第5外DB32/T4056-20214显子第52位为C碱基，证明含此突变位点，如为T碱基，证明不含此突变位点，如为T/C碱基叠加，证明此突变位点为杂合位点。利用四引物Wxmw-O-F/O-R/I-F/I-R可扩增得到三种类型的DNA特征条带（图A.4）：扩增得到459bp和301bpDNA条带的样品，证明含Wxmw突变位点；扩增得到459bp和209bpDNA条带的样品，证明不含此突变位点，同时扩增得到459bp、301bp和209bpDNA条带的样品，证明此突变位点为杂合位点。（M：分子量标准；1,7-10为含第4外显子突变位点的特征条带，2-6为不含第4外显子突变位点的特征条带，11-12为杂合位点的特征条带）图A.2Wxmp或Wxmq第4外显子突变位点的分子标记检测电泳图谱（2,4为含第5外显子突变位点的特征序列，1,3,5-10为不含第5外显子突变位点的特征序列，11-12为杂合位点的特征序列）图A.3Wxmq第5外显子突变位点的核苷酸序列分析DB32/T4056-20215（M：分子量标准；1,4,8,9为含第5外显子突变位点的特征条带，2,6-7为不含第5外显子突变位点的特征条带，3,5为杂合位点的特征条带）图A.4Wxmw第6外显子分子标记检测的电泳图谱A.9.2判定原则用A.5.1中所述两种分子