SZDBZ 335-2018 转基因玉米Bt176及其产品微滴式数字PCR定量检测方法

转基因玉米Bt176及其产品微滴式数字PCR定量检测方法Detectionofinsect-resistantmaizeBt176anditsderivatesproductsusingdropletdigitalPCRmethod2018-12-05发布2018-12-30实施ICS67.050B04SZDB/Z深圳市标准化指导性技术文件SZDB/Z335—2018深圳市市场和质量监督管理委员会发布SZDB/Z335—2018I目次1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13术语和定义.........................................................................14原理...............................................................................15试剂耗材和主要仪器.................................................................15.1试剂耗材...........................................................................15.2主要仪器..........................................................................26操作步骤...........................................................................26.1抽样.............................................................................26.2试样制备.........................................................................26.3试样预处理.......................................................................26.4DNA模板制备......................................................................26.5微滴式数字PCR反应...............................................................27数据分析...........................................................................37.1设定阈值..........................................................................37.2质量控制...........................................................................37.3含量计算..........................................................................38结果分析与表述.....................................................................39检出限.............................................................................3SZDB/Z335—2018II前言本文件依据GB/T1.1-2009规则编制。本文件由深圳市经济贸易和信息化委员会提出并归口。本文件起草单位：深圳市农业科技促进中心、深圳市标准技术研究院。本文件主要起草人：邓汉超、莫洁华、李皓、侯红利、王学林、李永红、周志豪、周向阳、刘晋、周鹏、刘敏。SZDB/Z335—20181转基因玉米Bt176及其产品微滴式数字PCR定量检测方法1范围本文件规定了转基因玉米Bt176及其产品微滴式数字PCR定量检测的原理、试剂耗材和主要仪器、操作步骤、数据分析、结果分析和表述及检出限。本文件适用于转基因玉米Bt176及其产品的定量检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法农业部2031号公告—19—2013转基因植物及其产品成分检测抽样农业部1485号公告—4—2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1zSSⅡb基因zSSⅡbgene一种根部表达的玉米基因，本文件中用作内标准基因。3.2Bt176结构特异性序列structure-specificsequenceofBt176Bt176结构特异性序列为转入的抗虫基因cry1Ab与pepc-intron的边界序列。3.3微滴式数字PCRdropletdigitalPCR基于单模板分子PCR扩增并且对每个样品中的微滴逐个检测的一种核酸样品定量分析技术。3.4阈值threshold 区分阳性微滴和阴性微滴的界限值。4原理采用玉米内标基因zSSⅡb和玉米Bt176结构特异性序列引物和探针，对测试样、Bt176阳性对照、阴性对照及空白对照进行微滴式数字PCR扩增，根据阳性对照、阴性对照和空白对照确定阳性微滴和阴性微滴的阈值，分析软件自动计算测试样zSSⅡb基因和Bt176结构特异性序列的每微升体系所含拷贝数（拷贝数浓度copies/μL）。然后根据公式：转基因含量=（Bt176拷贝数浓度/zSSⅡb拷贝数浓度）×100%，计算试样中转基因玉米Bt176的含量。5试剂耗材和主要仪器5.1试剂耗材微滴式数字PCR反应试剂盒、微滴发生卡、微滴读取油、微滴生成油、96孔PCR板。引物和探针见表1。SZDB/Z335—20182表1引物探针名称、序列及片段大小引物名称产物大小序列（5′-3′）zSSⅡb-F88bpCGGTGGATGCTAAGGCTGATGzSSⅡb-RAAAGGGCCAGGTTCATTATCCTCzSSⅡb-PHEX-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-BHQ1Bt176-F100bpTGTTCACCAGCAGCAACCAGBt176-RACTCCACTTTGTGCAGAACAGATCTBt176-PFAM-CCGACGTGACCGACTACCACATCGA-BHQ15.2主要仪器分析天平（0.0001g）、离心机、超微量紫外分光光度计、微滴发生器、微滴读取仪、普通PCR扩增仪、超纯水仪等仪器设备。6操作步骤6.1抽样按农业部2031号公告—19—2013的规定执行。6.2试样制备按农业部2031号公告—19—2013的规定执行。6.3试样预处理按农业部1485号公告—4—2010的规定执行。6.4DNA模板制备按农业部1485号公告—4—2010的规定执行。6.5微滴式数字PCR反应6.5.1反应条件在进行微滴式数字PCR反应时需同时进行试样、阳性对照、阴性对照和空白对照的PCR反应，每个PCR反应设置4次平行。按照表2配制微滴式数字PCR反应体系，本文件用水符合GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。微滴式数字PCR扩增程序：1、95℃，5min（Ramp2℃/s）；2、95℃，30s（Ramp2℃/s）；3、58℃，1min；4、Goto2，39X；5、98℃，10min（Ramp2℃/s）；6、15℃，10min（Ramp1℃/s）。该程序为优化后的条件，可根据不同的酶作适当调整。表2扩增反应体系名称储备液浓度加样体积反应浓度DropletPCRSupermix2×10L1×zSSⅡb-F20mol/L0.9L900nmol/LzSSⅡb-R20mol/L0.9L900nmol/LzSSⅡb-P20mol/L0.25L250nmol/LBt176-F20mol/L0.9L900nmol/LBt176-R20mol/L0.9L900nmol/LBt176-P20mol/L0.25L250nmol/LDNA模板10-100ng/L2L-纯水-3.9L-总体积-20L-注：可根据使用的酶作相应的调整。SZDB/Z335—20183微滴式数字PCR的操作按照《InstructionManual,QX100™DropletGenerator》和《InstructionManual,QX100™DropletReaderandQuantaSoft™Software》执行。6.5.2对照设置阳性对照：转基因玉米Bt176材料或阳性质粒；阴性对照：非转基因玉米材料作为阴性对照，以非玉米的DNA作为zSSⅡb内标基因检测的阴性对照；空白对照：无菌水。7数据分析7.1设定阈值根据阳性对照、阴性对照和空白对照设定阳性微滴和阴性微滴的最优界限值。7.2质量控制阴性对照和空白对照的阳性微滴数小于等于3copies（拷贝数浓度×反应总体积）；平行反应之中组内RSD值应不大于25%；同一样品不同重复的拷贝数重复性良好；同时满足上述三个条件，否则重新检测。7.3含量计算根据阳性对照、阴性对照和空白对照确定阳性微滴和阴性微滴的阈值，分析软件自动计算测试样zSSⅡb基因和Bt176结构特异性序列的每微升体系所含拷贝数（拷贝数浓度copies/μL）。然后根据公式：转基因含量=（Bt176拷贝数浓度/zSSⅡb拷贝数浓度）×100%，计算试样中转基因玉米Bt176的含量。8结果分析与表述定量检测结果有3种情况，每种检测结果应表述如表3表3定量结果表述检测结果结果表述百分比含量0.5%试样中转基因玉米Bt176含量为X%0%百分比含量0.5%试样中转基因玉米Bt176含量低于0.5%百分比含量=0%试样中转基因玉米Bt176含量为0%9检出限本文件方法的检测限（LOQ）为0.5%。_________________________________