DB37T 3570-2019 奶牛A2型β-酪蛋白基因检测技术规程

ICS65.020.01B40DB37山东省地方标准DB37/T3570—2019奶牛A2型β-酪蛋白基因检测技术规程CodeofpracticefordetectionofA2typeofβ-caseingeneindairycattle2019-05-29发布2019-06-29实施山东省市场监督管理局发布DB37/T3570—2019I目次前言................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13术语和定义.........................................................................14检测原理...........................................................................25主要试剂...........................................................................26主要仪器设备.......................................................................27检测方法...........................................................................27.1样本采集.......................................................................27.2DNA提取........................................................................27.3多重PCR扩增...................................................................27.4多重连接酶检测反应.............................................................37.5变体型分析.....................................................................38结果判定...........................................................................38.1多重PCR扩增产物的检测.........................................................38.2A2型β-酪蛋白结果判定..........................................................49废弃物的处理.......................................................................410检测过程中防止交叉污染的措施......................................................5附录A（资料性附录）主要试剂配制................................................6附录B（资料性附录）主要仪器设备................................................7附录C（规范性附录）多重连接酶检测反应探针引物..................................8DB37/T3570—2019II前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、山东奥克斯畜牧种业有限公司、大同市南郊区四方高科农牧有限公司、中国农业大学、江苏省农业科学院畜牧研究所。本标准主要起草人：黄金明、王秀革、鞠志花、姜强、王玲玲、张思聪、张亚冉、高亚平、魏晓超、刘文浩、高运东、侯明海、曲绪仙、段志伟、戴蕴平、仲跻峰。DB37/T3570—20191奶牛A2型β-酪蛋白基因检测技术规程1范围本标准规定了奶牛A2型β-酪蛋白基因检测的技术方法。本标准适用于奶牛A2型β-酪蛋白基因的检测与分型。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2—2004转基因产品检测实验室技术要求GB/T27642—2011牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法DB37/T2037—2012牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）基因分子检测技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1A2型β-酪蛋白A2β-casein，A2CSN2Beta酪蛋白（β-酪蛋白）含有多种蛋白变体型（A1、A2、A3、B、C、E、F、H1、I）。β酪蛋白不同变体型之间的区别就在于β酪蛋白基因（CSN2）编码区一个或几个碱基的变化，导致相应氨基酸的改变。当CSN2基因编码区上的8个SNP位点c.151G＞A、c.154G＞A、c.245C＞A、c.307C＞A、c.322A＞C、c.363C＞A、c.411C＞G、c.500C＞T，基因型分别为c.151（GG）、c.154（GG）、c.245（CC）、c.307（CC）、c.322（AA）、c.363（CC）、c.411（CC）和c.500（CC）时，称为A2型β酪蛋白。3.2A2奶牛A2Cow拥有A2型β酪蛋白基因的奶牛，简称为A2奶牛。3.3多重PCRmultiplexPCR又称多重引物PCR或复合PCR，是指在同一PCR反应体系中加上两对或两对以上引物，同时扩增出多个对应的目标核酸片段的PCR反应。3.4多重连接酶检测反应multiplexligasedetectionreaction，MLDRDB37/T3570—20192是一种利用高温连接酶实现对基因多态性位点识别的高特异性基因检测技术。4检测原理基于奶牛β-酪蛋白基因序列（参考序列：ENSBTAT00000003409），结合β-酪蛋白不同变体型（A1，A2，A3，B，C，E，F，H1，I）对应的8个SNP位点（c.151G＞A、c.154G＞A、c.245C＞A、c.307C＞A、c.322A＞C、c.363C＞A、c.411C＞G、c.500C＞T），设计两对特异性引物（Primermix）进行多重PCR扩增出8个SNP位点所在的目的DNA片段；再对每个SNP位点设计三条探针引物（Probemix），其中在SNP位点一侧设计两条特异性检测探针（每条探针的3’端与突变位点的一种基因型互补），在另一侧设计一条与模板完全匹配的荧光标记探针；然后在连接酶的作用下，以扩增的多重PCR产物为模板，当两侧的探针与目的DNA序列完全互补时连接反应才能进行；最后通过ABI3730XL测序仪，扫描连接反应所产生的片段长度，实现对不同SNP位点的检测。5主要试剂除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的双蒸水；高压灭菌条件为121℃，1.034×105Pa压力，蒸汽灭菌20min。试剂见附录A。6主要仪器设备见附录B。7检测方法7.1样本采集颈静脉采集血样3mL～5mL，ACD抗凝，-20℃保存。对公牛，亦可采集2～3剂细管精液（0.25mL或者0.5mL规格），液氮保存。0.1g～0.3g组织（耳组织、肌肉）或带毛囊的牛毛浸入75%的酒精，-20℃保存备用。7.2DNA提取7.2.1血液DNA的提取血液DNA提取按DB37/T2037—2012中7.2.1规定的方法执行。7.2.2精液DNA提取精液DNA提取按DB37/T2037—2012中7.2.2规定的方法执行。7.2.3组织和带毛囊的牛毛DNA提取组织和带毛囊的牛毛DNA的提取按GB/T27642—2011中附录B规定的方法执行。7.3多重PCR扩增7.3.1多重PCR扩增引物设计DB37/T3570—20193根据Ensembl数据库中β-酪蛋白基因序列（参考序列：ENSBTAT00000003409），并结合β-酪蛋白不同变体型对应的SNP突变序列信息（c.151G＞A、c.154G＞A、c.245C＞A、c.307C＞A、c.322A＞C、c.363C＞A、c.411C＞G、c.500C＞T），设计两对多重PCR扩增引物CNS2-MP1（F：5’-GGAATCTATTACACGCATCAA-3’；R：5’-TTGCACTGACATTTATATTACCA-3’，扩增长度274bp)和CNS2-MP2（F：5’-GCCCAGACACAGTCTCTAGTC-3’；R：5’-TGAATGGGCATATCTCTCTG-3’，扩增长度419bp）扩增SNP位点所在片段。7.3.2多重PCR扩增反应体系20µL的反应体系，包括1µLDNA（50ng/µL）、2µLPrimermix（引物CNS2-MP1和CNS2-MP2各0.5pM）、2µLdNTP（2mM/each）、0.2µLTaq酶（1U）、0.6µLMg2+（3mM）、2µLBuffer（1×）、12.2µLddH2O。7.3.3多重PCR反应条件95℃2min。94℃30s，59℃90s，65℃1min，40个循环。65℃10min。7.4多重连接酶检测反应7.4.1多重连接酶检测反应探针引物设计针对每个SNP位点（c.151G＞A、c.154G＞A、c.245C＞A、c.307C＞A、c.322A＞C、c.363C＞A、c.411C＞G、c.500C＞T）设计3条引物，包括在SNP位点一侧设计2条特异性检测探针（每条探针的3’端与突变位点的一种基因型互补），在SNP的另一侧设计一条与模板完全匹配的荧光标记探针，探针序列的5’端碱基磷酸化（P），且3’端带有6-羧基荧光素（FAM）报告基团，所述荧光标记探针引物的序列如附录C所示。7.4.2多重连接酶检测反应体系1µLBuffer（1×）、1µLProbemix（each）（2pmol/µL）、0.05µLTaqDNAligase（2U）、4µLddH2O、4µL多重PCR产物。7.4.3多重连接酶检测反应条件95℃2min。94℃15s，50℃25s，40个循环。7.5变体型分析检测反应完成后，通过ABI3730XL测序仪，扫描连接反应所产生的片段长度，应用Genemapper软件分析8个SNP位点的基因型，经单倍型分析，确定β-酪蛋白的不同变体型。8结果判定8.1多重PCR扩增产物的检测利用3%琼脂糖凝胶电泳对多重PCR扩增产物进行检测，可以看到清晰的两条带419bp和274bp（见图1），表明多重PCR产物质量合格，可以应用于多重连接酶检测反应。DB37/T3570—201941-9泳道对应样品1-9图1多重PCR扩增产物的3%琼脂糖凝胶电泳图8.2A2型β-酪蛋白结果判定通过ABI3730XL测序仪扫描多重连接酶反应产物，根据Genemapper软件输出峰图以及不同SNP位点组合对应的变体型，统计β-酪蛋白的不同变体型。当奶牛CSN2基因的8个S