DB22T 1819-2013 饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的测定-分光光度法

ICS65.120B46备案号：37938-2013DB22吉林省地方标准DB22/T1819—2013饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的测定分光光度法DeterminationofacidicproteaseactivityinfeedenzymepreparationsSpectrophotometricmethod2013-05-15发布2013-09-01实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1819—2013I前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2009给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准起草单位：吉林省产品质量监督检验院。本标准主要起草人：王伟、李媛媛、王莹、安伟、杨波。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1819—20131饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的测定分光光度法1范围本标准规定了饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的单位定义和测定分光光度法。本标准适用于饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1酸性蛋白酶活力单位在40℃、pH3.0条件下，酸性蛋白酶1min水解酪素生成1µg酪氨酸所需要的酶量为一个酶活力单位U。4原理酸性蛋白酶水解酪素产生酪氨酸，在碱性条件下含有酚基的酪氨酸将福林试剂还原生成钼蓝与钨蓝。溶液的颜色与酶解产生的酪氨酸的量成正比，而酪氨酸的生成量与反应液中酸性蛋白酶的活力成正比。用分光光度计测定其吸光度值，根据吸光度值计算酶制剂中酸性蛋白酶活力。5试剂及材料标准中所有试剂，除另有规定外均为分析纯试剂，实验用水应符合GB/T6682规定的三级以上用水要求。5.1盐酸。5.2磷酸。5.3钨酸钠（Na2WO4·2H2O）。5.4钼酸钠（Na2MO4·2H2O）。5.5硫酸锂（Li2SO4）。5.6溴水。5.7无水碳酸钠。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1819—201325.8三氯乙酸。5.9乳酸（80%～90%）。5.10乳酸钠（70%）。5.11酪素。5.12L-酪氨酸标准品（含量≥99.0%）CAS：60-18-4。5.13福林试剂于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MO4·2H2O）25g、水700mL、85%磷酸50mL、盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷凝管，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有绿色需再加溴水，在煮沸除去过量的溴），冷却转移至1000mL容量瓶中，加水定容至刻度。混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，储存于棕色瓶中内。5.14福林工作溶液取一份福林试剂与两份水混合，摇匀即为福林工作溶液。5.15碳酸钠溶液（0.4mol/L）称取无水碳酸钠42.4g，用水溶解并定容至1000mL。5.16三氯乙酸溶液（0.4mol/L）称取无水三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL。5.17盐酸溶液（0.1mol/L）量取盐酸9mL，用水溶解并定容至1000mL。5.18盐酸溶液（1mol/L）量取盐酸90mL，用水溶解并定容至1000mL。5.19乳酸缓冲（pH3.0）甲液称取乳酸10.6g，加水溶解并定容至1000mL。乙液称取乳酸钠16g，加水溶解并定容至1000mL。取甲液8mL、乙液1mL混合，加水9mL稀释，摇匀即为pH3.0的乳酸缓冲溶液。5.20酪素溶液（10g/L）称取酪素1.0g置研钵中（精确至0.0001g），加乳酸2～3滴湿润，研磨3min，加入15mL乳酸缓冲溶液，静置，将上清液转移至100mL容量瓶中。残渣继续研磨至少3min，加入10mL乳酸缓冲溶液，静置，将上层清液转移至容量瓶中，如此反复至少3次，将酪素全部转移至容量瓶中。在沸水浴中加热至完全溶解，冷却后用乳酸缓冲液定容至刻度。该溶液在4℃贮存，有效期3d。5.21L-酪氨酸标准贮备溶液称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1g（精确至0.001g），用1mol/L的盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL容量瓶中，即为1mg/mL酪氨酸标准贮备溶液，该溶液在4℃贮存，有效期3d。5.22L-酪氨酸标准溶液准确量取1mg/mL酪氨酸标准贮备溶液10.0mL置100mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸定容至刻度，即得到100μg/mLL-酪氨酸标准溶液，该溶液现用现配。6仪器6.1紫外-可见分光光度计。6.2分析天平：感量0.0001g。6.3酸度计：精确至0.01。6.4电加热器。6.5研钵。6.6恒温水浴摇床：温控范围30℃～60℃，精度±0.2℃。6.7比色管：25mL。6.8秒表。7分析步骤7.1样品制备本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1819—20133称取适量试样（精确至0.001g）置研钵中，用少量乳酸缓冲液（5.19）润湿，研磨至少3min，加入15mL乳酸缓冲液（5.19）混匀，静置，将上层清液转移至100mL容量瓶中。沉渣部分继续重复上述操作至少3次，将试样全部转移入容量瓶中，用乳酸缓冲液（5.19）定容至刻度，摇匀。根据酶活力用乳酸缓冲液（5.19）稀释至适当浓度，供测试样（酶活力应控制在8U/mL～10U/mL范围内）。7.2样品测定7.2.1样品空白测定溶液准确量取上述测定溶液（混悬溶液，摇匀后立即量取）1.0mL于25mL比色管中，置温度40℃±0.2℃、振摇速度100次/min的水浴摇床中预热2min，加入2.0mL三氯乙酸溶液（5.16），摇匀，再置水浴摇床中保温10min（准确计时）。取1.0mL酪素溶液（5.20）加入上述比色管中，摇匀，静置10min，用定量滤纸过滤，滤液备用。准确量取滤液1.0mL置于另一比色管中，加5.0mL碳酸钠溶液（5.15），加1.0mL福林工作溶液（5.14），置温度40℃±0.2℃的水浴摇床中显色20min（准确计时），作为样品空白测试溶液。7.2.2样品测定溶液准确量取上述测定溶液（混悬溶液，摇匀后立即量取）1.0mL于25mL比色管中，置温度40℃±0.2℃、振摇速度100次/min的水浴摇床中预热2min，加1.0mL酪素溶液（5.20），摇匀，再置水浴摇床中保温10min（准确计时）。取2.0mL三氯乙酸溶液（5.16）加入上述比色管中，摇匀，静置10min，用定量滤纸过滤，滤液备用。准确量取滤液1.0mL置于另一比色管中，加5.0mL碳酸钠溶液（5.15），加1.0mL福林工作溶液（5.14），置温度40℃±0.2℃的水浴摇床中显色20min（准确计时），作为样品测试溶液。7.2.3绘制L-酪氨基酸标准曲线准确量取L-酪氨酸标准溶液（5.21）0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，分别置于6只10mL容量瓶中，加水定容至10mL，即浓度为0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的标准工作溶液。分别取L-酪氨酸标准工作溶液1.0mL置于另外6只25mL比色管中，各加5.0mL碳酸钠溶液（5.15）和1.0mL福林工作溶液（5.14）mL，置40℃±0.2℃水浴摇床中显色20min（准确计时），作为标准测试溶液。以0浓度标准测试溶液为参比，在680nm波长处分别测定其吸光度。以吸光度A为横坐标，酪氨酸的浓度C为纵坐标，计算出标准曲线回归方程。7.2.4测定以0浓度标准测试溶液为参比，在680nm波长处测定样品空白测试溶液和样品测试溶液的吸光度，用标准曲线回归方程计算出对应的L-酪氨酸量，该溶液能够保持稳定至少2h。7.3结果计算与表述7.3.1结果计算酸性蛋白酶活力按（1）式计算：mnwX××=10.......................................(1)式中：X——酶活力单位，U/g;本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T1819—20134w——用回归方程计算出的试样溶液相当的L-酪氨酸量，μg；n——试样溶液总稀释倍数；10——酶反应时间，min；m——试样质量，g。8精密度两平行测定结果的允许相对偏差不大于3.0%。_________________________________本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印