JJF(黔) 60-2021 荧光定量聚合酶联反应分析仪校准规范

贵州省市场监督管理局发布贵州省地方计量技术规范JJF（黔）60-2021荧光定量聚合酶链反应分析仪校准规范CalibrationSpecificationofFluorescentQuantitativePolymeraseChainReactionAnalyzerXXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施JJF（黔）XX－2021荧光定量聚合酶链反应分析仪校准规范CalibrationSpecificationofFluorescentQuantitativePolymeraseChainReactionAnalyzer归口单位：贵州省市场监督管理局主要起草单位：贵州省计量测试院参加起草单位：贵阳市第一人民医院北京林电伟业电子技术有限公司本规范委托贵州省计量测试院负责解释JJF(黔)60—2021JJF（黔）XX－2021本规范主要起草人：周选超（贵州省计量测试院）赵才贤（贵州省计量测试院）谢小艳（贵州省计量测试院）参加起草人：张磊（贵州省计量测试院）韩成（贵州省计量测试院）黎洪（贵州省计量测试院）王博（贵阳市第一人民医院）李征（北京林电伟业电子技术有限公司）JJF（黔）XX－2021I目录引言...........................................................（II）1范围.........................................................（1）2引用文件.....................................................（1）3术语和定义...................................................（1）4概述.........................................................（2）5计量特性.....................................................（3）6校准条件.....................................................（3）6.1环境条件..................................................（3）6.2测量标准及其他设备........................................（4）7校准项目和校准方法...........................................（4）7.1校准项目..................................................（4）7.2校准方法..................................................（4）8校准结果表达与处理..........................................（10）8.1校准记录..................................................（10）8.2校准结果的处理............................................（10）9复校时间间隔...............................................（11）附录A校准记录格式...........................................（12）附录B校准证书内页格式.......................................（15）附录C温度示值误差和Ct值示值误差的测量不确定度评定示例.......（16）JJF（黔）XX－2021II引言本规范依据JJF1071-2010《国家计量校准规范编写规则》和JJF1001-2011《通用计量术语及定义》、JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》编制。其计量特性和校准方法参照了JJF1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》、YY/T1173-2010《聚合酶链反应分析仪》、SN/T2102.2-2008/ISO/TS20836:2005《食源性病原体PCR检测技术规范.第2部分：PCR仪性能试验要求》。JJF（黔）XX－20211荧光定量聚合酶链反应分析仪校准规范1范围本规范适用于荧光定量聚合酶链反应分析仪的校准。2引用文件本规范引用了下列文件：JJF1527-2015聚合酶链反应分析仪校准规范YY/T1173-2010聚合酶链反应分析仪SN/T2102.2-2008/ISO/TS20836:2005食源性病原体PCR检测技术规范.第2部分：PCR仪性能试验要求凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本规范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本规范。3术语3.1聚合酶链反应polymerasechainreaction，PCR一种对特定的DNA或RNA片段在体外进行快速扩增的方法，由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。3.2温度最大过冲量temperaturemaximumshoot仪器均热快温度升高或降低至设定值过程中，所有采样孔温度超出设定温度值的最大幅度。3.3荧光染料fluorochrome由短波长激发光激发，释放出可见光的试剂。注：常见的荧光染料有FAM、HEX、TexasRed、VIC、Cy3、ROX等。3.4荧光强度检测精密度precisionoffluorescenceintensity对多个检测孔在同一荧光条件下重复荧光强度测量，其测量值的一致性。3.5阈值循环数Ct(Cp)cyclethresholdcycle,crossingpoint实时监测扩增过程中，反应管内的荧光信号到达指数扩增时经历的循环周期数。主要的计算方式是以扩增过程前3～15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为阈值循环数（Ct），简称Ct值。JJF（黔）XX－202123.6Ct值精密度precisionofthresholdcycle对多个测量孔在同一荧光条件下重复Ct值测量，其测量值的一致性。3.7熔解温度melttemperature总的DNA双螺旋结构降解一半时的温度，简称𝑇𝑚值，不同序列的DNA，𝑇𝑚值不同。3.8熔解温度漂移melttemperaturebias同一熔解温度在不同通道发生漂移形成多峰的现象，熔解温度值与光学标准器熔解温度设定值之差。3.9熔解曲线meltcurvePCR扩增反应过程中，均热快采样孔的荧光强度与温度形成的曲线。3.10峰值高度peakheights熔解曲线上扩增产物的熔解温度对应特征峰的高度。3.11通道峰值高度一致性channelpeakheightconsistency不同采样孔在同一熔解温度对应峰值高度的一致性。3.12线性灵敏系数linearsensitivityfactor表征熔解曲线线性变化灵敏程度具体化参数。4概述荧光定量聚合酶链反应分析仪（fluorescentquantitativepolymerasechainreactionanalyzer，以下简称荧光定量PCR仪）为在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的仪器。荧光定量PCR分析仪主要通过仪器内部热循系统的升降温变化，使得脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid，DNA）或核糖核酸（RibonucleicAcid，RNA）片段得以复制扩增，仪器光学系统采集伴随DNA或RNA扩增产生的荧光信号，并对荧光信号进行分析转化、数学运算后，得到扩增和熔解曲线。通常荧光定量PCR仪由温度控制系统、光学系统和控制系统组成，常见的荧光定量PCR仪有32孔、48孔、96孔等，其中96孔使用最广泛。荧光定量PCR仪检测原理图见图1。JJF（黔）XX－20213图1荧光定量PCR仪检测原理图5计量特性荧光定量PCR仪计量特性见表1。表1荧光定量PCR仪计量特性项目指标温度参数温度示值误差/℃设定温度点/℃：30、50、60、70、90、95±0.5温度均匀度/℃≤1.0温度最大过冲量/℃≤3.0平均升温速率/(℃/s)升温范围：50℃～90℃≥1.5平均降温速率/(℃/s)降温范围：90℃～50℃≥1.5光学系统物理方法参数Ct值示值误差±2.5Ct值均匀度≤5Ct值精密度/%≤10通道峰值高度一致性±0.2线性灵敏系数±0.2熔解温度漂移/℃±1光学系统生物化学方法参数荧光强度精密度/%≤5样本精密度/%≤3荧光线性相关系数≥0.990样本线性相关系数≥0.9806校准条件6.1环境条件6.1.1环境温度：（15～30）℃。JJF（黔）XX－202146.1.2相对湿度：（20～85）%。6.1.3应远离振动、电磁干扰。6.2测量标准及其他设备6.2.1温度标准器测温范围为（0～120）℃，最大允许误差为±0.1℃。6.2.2光学标准器波长范围为（380～780）nm，相对光辐射强度为（10～100）%。6.2.3标准物质校准时应采用有证标准物质，包括质粒DNA标准物质、核糖核酸标准物质，其特性量值（拷贝数≥109copies/μL，相对扩展不确定度≤5%）。6.2.4移液器规格：2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL，需通过计量检定/校准。7校准项目和校准方法7.1校准项目温度控制系统校准项目为温度参数校准，光学系统校准项目可选择物理方法参数校准或生物化学方法参数校准。7.2校准方法7.2.1校准前准备开机预热30min，将被校仪器与温度标准器和光学标准器各部件连接完好。在精密温度传感器表面上涂抹适量导热油，并确保与加热模块接触良好。温度和光学标准器分布于均热模块采样孔中，96孔荧光定量PCR仪标准器位置分布示意图见图2，其他孔数的荧光定量PCR仪参照图2放置标准器。a）7个标准器位置分布b）15个标准器位置分布图296孔荧光定量PCR仪标准器位置分布示意图JJF（黔）XX－202157.2.2设置校准程序参照被校荧光定量PCR仪说明书设定控制程序，校准控制程序见表2，不能设定30℃为程序起点的荧光定量PCR仪，参照表2进行设定。整个校准程序包括预热、温度控制、模拟光学扩增、扩增变性和熔解曲线分解五个子程序。表2校准控制程序程序步骤设定温度点/℃设定温度持续时间/s预热130602956033060温度控制4306059518063012079018085018097018010601801130180模拟光学扩增（此过程重复32个循环）128510136030扩增变性149515熔解曲线分解156030～951695157.2.3温度参数校准7.2.3.1按照7.2.2中的控制程序进行温度参数的校准，启动控制程序，运行结束后，读取温度标准器的标准值和被校荧光定量PCR仪的测量值。7.2.3.2温度示值误差按公式（1）进行计算。∆𝑇=𝑇𝑠−𝑇𝑐̅(1)式中：∆𝑇——温控装置工作区域内温度示值误差，℃；𝑇𝑠——温控装置工作区域内设定温度值，℃；𝑇𝑐̅——所有测温传感器测量值的平均值，℃。JJF（黔）XX－202167.2.3.3温度均匀度按公式（2）进行计算。∆𝑇𝑢=𝑇𝑚𝑎𝑥−𝑇𝑚𝑖𝑛(2)式中：∆𝑇𝑢——温度均匀度，℃；𝑇𝑚𝑎𝑥——所有采样孔测量值的最大值，℃；𝑇𝑚𝑖𝑛——所有采样孔测量值的最小值，℃。7.2.3.4采样孔从30℃上升至95℃过程的温度过冲量示意图见图3a），从95℃下降至30℃过程的温度过冲量示意图见图3b）。所有采样孔内温度最大过冲量按公式（3）进行计算。a）温度上升过程温度过冲量b）温度下降过程温度过冲量图3单个采样孔温度过冲量示意图∆𝑇𝑂𝑆=