第五章环境化学物的特殊毒性及其评价

第五章环境化学物的特殊毒性及其评价第一节环境化学物的致突变性及其评价一、概述物种的各个体和各代之间的种种变化称为变异。可遗传变异即称为突变（mutation）。有自发的和诱发的。相当多的外来化学物能直接损伤DNA或产生其他遗传学改变而使基因和染色体发生改变——遗传毒物或致突变物或诱变剂。二、突变的类型突变的基础是遗传物质的DNA改变，根据DNA改变牵涉的范围大小，可以将遗传损伤分为三类：基因突变、染色体突变和基因组突变。（一）基因突变指在基因序列中DNA序列的改变，也叫点突变。1、碱基置换碱基置换指DNA序列上的某个碱基被其他碱基取代。首先在DNA复制时会使互补链的相应位点配上一个错误的碱基，即发生错误配对。这一错误配上的碱基在下一次DNA复制时却能按正常规律配对，于是一对错误的碱基置换了原来的碱基对，亦即最终产生碱基对置换或简称碱基置换。转换（transition）：嘌呤与嘌呤碱基之间的置换，或嘧啶与嘧啶之间的置换。颠换（transversion）：嘌呤与嘧啶碱基之间的置换。2、移码移码是从mRNA到蛋白质翻译过程中遗传密码子读码顺序的突变，通常是基因中增加或减少了一对或几对不等于3的倍数的碱基对所造成的突变。3、整码突变指在DNA中增加或减少的碱基对为一个或几个密码子。4、片断突变指基因中某些小片断核苷酸序列发生改变。这种损伤有时可跨越两个或数个基因。片断突变包括缺失、重复、重组、重排。（二）染色体突变也称染色体畸变，是染色体或染色体单体受损而发生断裂，且断端不发生重接或虽重接却不在原处。能使染色体或染色单体发生断裂的物质称为断裂剂，这种作用的发生及其过程称为断裂作用。断裂作用的关键是诱发DNA链断裂。（1）裂隙（gap）在染色体上出现无染色质的区域，但该区域两端的染色体仍保持线状连接者为裂隙。一般认为裂隙属于非染色质损伤。裂隙不计入畸变范围。（2）断裂（break）指染色体上狭窄的非染色带,无线状连接者为断裂。（3）断片（fragment）和缺失（deletion）一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，并且这些已断裂的节段远远分开，常将无着丝粒断片简称为断片。有着丝粒的部分称为缺失，缺失有末端缺失和中间缺失。（4）微小体（minutebody）中间缺失如断片很小，小于染色单体宽度，呈圆点状，称为微小体。（5）无着丝粒环（acentricring）一条较长的无着丝粒断片的两端连接，就形成无着丝粒环。（6）环状染色体（ringchromosome）染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒的节段的两断端连接形成一个环时，称为环状染色体。（7）双着丝粒染色体（dicentricchromosome）两条染色体断裂后，两个有着丝粒的节段重接形成。（8）倒位（inversion）当某一染色体发生两次断裂后，其中间节段倒转180再重接，称为倒位。臂间倒位：颠倒的是具有中间着丝粒的中间节段臂内倒位：颠倒的是长臂或短臂内的一段（9）易位（translocation）两个非同源染色体断裂后，从某个染色体断下的节段接到另一染色体上称为易位。两条染色体同时断裂，相互交换断片并重接——相互易位仅一个染色体节段连接到另一染色体上——单方易位；三个或三个以上染色体断裂、重接——复杂易位（10）插入（insertion）和重复（duplication）当一个染色体发生三处断裂，带有两断端的断片插入到另一臂的断裂处或另一染色体的断裂处重接起来，称为插入。如此时有缺失的染色体和有插入的染色体是同源染色体，且分别有一处断裂发生于同一位点，则插入将使该染色体连续出现两段完全相同的节段，此时称为重复。（11）辐射体染色体间的不平衡易位可形成三条臂构型或四条臂构型，分别称为三辐射体和四辐射体。在多个染色体间的单体互换可形成复合射体。（三）基因组突变指基因组中染色体数目的改变，也称染色体数目畸变。1、非整倍体指细胞丢失或增加一条或多条染色体。缺失一条染色体称为单体，增加一条染色体称为三体。2、整倍体指染色体数目的异常是以染色体组为单位的增减，如三倍体、四倍体。三、致突变作用机理外源化学物引起基因突变和染色体突变的靶部位主要是DNA，而导致染色体数目异常的靶部位主要是有丝分裂和减数分裂器，如纺锤丝。（一）DNA损伤和突变1、碱基类似物的取代有些化学物的结构与碱基非常相似，称碱基类似物。它们能可与天然碱基竞争，并取代其位置，而掺入到DNA分子中，引起剑姬配对特性的改变，引发突变。2、与DNA分子共价结合形成加合物许多亲电子性化学物可与DNA作用形成加合物（adduction）。不同诱变剂与DNA作用的碱基位置不同，可引起不同类型的突变。烷化剂可提供甲基或乙基等烷基，与DNA发生共价结合。对DNA和蛋白质都有强烈烷化作用。各类烷化剂烷化活性有别，一般情况下甲基化＞乙基化＞高碳烷基化。3、改变或破坏碱基的化学结构某些诱变剂可与碱基发生相互作用，使碱基发生化学结构变化，引起错误配对或引起DNA链断裂。例如，亚硝酸根能使腺嘌呤和胞嘧啶发生氧化性脱氨，相应变为次黄嘌呤和尿嘧啶。4、大分子嵌入DNA链如吖啶类染料（吖啶橙），是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤-嘧啶对十分相似，能嵌入两个相邻的DNA碱基对之间，造成移码突变。(二)非整倍体及整倍体的诱发非整倍体畸变的原因：（1）不分离：同源染色体在第一次减数分裂中不分离；姐妹染色体在第二次减数分裂或有丝分裂中不分离。（2）染色体丢失由于纺锤体形成不完全或着丝粒受损使得染色体在分离过程中没有进入任一个子细胞核中。整倍体诱发的原因1、纺锤体受损，有丝分裂染色体组不分离，形成四倍体；2、减数分裂异常使配子形成二倍体，若二倍体的配子受精，可形成多倍体受精卵；3、一个卵子被多个精子受精，形成多倍体。（三）DNA损伤的修复和突变1、生物体DNA损失修复系统（1）复制前的修复过程——精确修复，包括直接修复和切除修复a、直接修复：包括光修复和O6－甲基鸟嘌呤修复光修复：针对紫外线引起的嘧啶二聚体修复功能，修复的过程是通过在波长范围为320～370mm的可见光中，二聚体可直接恢复成原来的样子。催化光复活反应的酶叫做光裂合酶。O6-甲基鸟嘌呤修复：修复在O6位上含有烷基的鸟嘌呤，靠O6-甲基鸟漂吟-DNA-甲基转移酶将O6-甲基鸟嘌呤的甲基转移至该酶的半胱氨酸残基上，而恢复鸟嘌呤正常的碱基配对特性，该酶在修复过程中被不可逆地失活。b、切除修复(excixion-repair)由于这过程并不依赖于光的存在故又称为暗修复（darkrepair）。依据切除对象的不同，分为核苷酸切除修复（大段异常核苷酸）；碱基切除修复（个别异常碱基）；错配碱基修复核苷酸切除修复(nucleotideexcisionrepair)是所有生物体内最常见的修复机制。它可修复几乎所有的DNA损伤类型，包括其他修复机制不能修复的加合物及DNA链间交联等。修复时，先靠内切酶把DNA链从损伤两端切断；在解螺旋酶作用下，除去受损的寡核苷酸；再在修复多聚酶的作用下，以对应的链为模板，以正确的碱基填补空隙；最后在DNA连接酶作用下连接，恢复原来的序列。碱基切除修复：abcde图12-16DNA碱基切除修复A：六边型表示错误的碱基B：DNA糖基化酶切除错误的碱基C：AP内切核酸酶及AP裂解酶切除磷酸二酯链及糖基D：DNA聚合酶填补单一核苷酸。E：DNA连接酶封闭缺口错配碱基修复(mismatchbaserepair)是一种特殊的切除修复形式，通过该机制可去除不正确的碱基配对，如G：T和A：C。（2）复制后修复这个系统是在DNA复制时模板链上含有损伤的碱基导致子链产生裂缺，这是在复制时产生的，所此修复系统也属于复制后修复。复制时新合成的互补链相应部位出现空隙，随后以重组作用及链延长作用填补。通过此机制，使DNA合成得以通过损伤部位，避免了致死性的后果，但存在的DNA损伤并末移除，仍有待通过其他的修复机制而修复。2.DNA损伤修复与突变突变的产生不仅与DNA受损的情况有关，DNA损伤修复也是决定突变发生与否的重要因素。DNA损伤修复功能的缺失或修复能力降低都会使突变的发生明显增加。不同生物损伤修复功能的类型及能力有所不同，如人类的修复能力比小鼠大10倍左右。在使用元原核生物及动物进行致突变试验，并用其结果外推到人时，要考虑到DNA损伤修复系统的差别。DNA损伤修复过程涉及许多酶的参与。同代谢酶的多态性一样，DNA损伤修复酶也有多态性，即其基因型或表型存在个体差异。DNA损伤修复酶的多态性在一定程度上影响着个体对遗传毒性因素的易感性。四、突变的不良后果突变的靶细胞有体细胞和生殖细胞（一）体细胞突变的后果1、癌变2、畸变：胚胎体细胞突变，造成畸胎3、其他不良后果：动脉粥样硬化、衰老。（二）生殖细胞突变的后果1、致死性2、可遗传的改变：显性遗传病、隐性遗传病五、致突变作用的评价（一）致突变试验的分类目前有200多种，重要的和常规使用的大约20多种。依据检测的遗传学终点的不同，可分为四类：基因突变试验、染色体损伤试验、非整倍体试验和其他反映DNA损伤的试验。（二）常用的致突变试验1、细菌回复突变试验细菌回复突变试验是以营养缺陷的突变体菌株为试验系统，观察受试物引起其回复突变的作用。常用的菌株：色氨酸营养缺陷型的大肠杆菌——大肠杆菌回复试验组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌——Ames实验原理：Ames试验，检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力。试验菌株都有组氨酸突变(his-)，不能自行合成组氨酸，在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长，回复突变成野生型后能自行合成组氨酸，可在最低营养平皿上生长成可见菌落。计数最低营养平皿上的回变菌落数来判定受试物是否有致突变性。2.哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物细胞基因突变试验是利用啮齿类和人体外培养细胞的基因正向突变试验。常用细胞株选用的基因小鼠淋巴瘤细胞L5178YTK、HPRT中国仓鼠卵巢组织细胞CHOHPRT中国仓鼠肺组织细胞V79HPRT人淋巴细胞HPRT（1）tk基因位于常染色体上，编码胸苷激酶，催化胸腺嘧啶脱氧核苷＋ATP→胸苷酸。存在嘧啶类似物5－溴脱氧尿苷时，产生异常核苷酸使细胞死亡。受试物存在时若细胞不死亡说明TK发生突变。（2）hprt基因位于X染色体上，编码次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶：催化次黄嘌呤＋鸟嘌呤＋磷酸核糖焦磷酸→核苷-5’-单磷酸（NMP）。如存在碱基类似物，生成相应的NMP，掺入到DNA中可致死。加入受试物后能存活的细胞表示发生基因突变。3、染色体畸变试验制备细胞分裂中期相染色体标本，在光镜下可直接观察染色体的数目和形态的改变。染色体畸变试验也常称为细胞遗传学试验(cytogeneticassay)。染色体畸变试验可为体外试验，也可为体内试验，包括对体细胞和生殖细胞的分析。结构畸变：可观察到裂隙、断裂、断片、微小体、环状染色体、双或多着丝粒染色体和射体。数目畸变：需在染毒后经过一次有丝分裂才能发现。但是经过一次有丝分裂后，一些结构畸变可能因遗传物质的丢失而致细胞死亡，因此不能发现。所以应安排多次收获时间，以便分别检查断裂剂的作用。体内试验：多观察骨髓细胞，其分裂旺盛、易于获得和制备，优势在于可体现哺乳动物的代谢过程、DNA修复和药物动力学特征。但应注意受试物或其活性代谢产物有可能不易在骨髓中达到足够的浓度。体外试验：常用中国仓鼠肺细胞(CHL)，以及中国仓鼠卵细胞(CHO)和V79等细胞系，但任何细胞系的染色体皆不稳定，不能准确地观察非整倍体，故在体外试验中，如考虑进行染色体数目观察，应当使用原代或早代细胞4、微核试验微核是染色体的断片或迟滞的染色体在细胞分裂后期，由于不能进入子细胞的核中而在间期的子细胞胞浆内形成的游离团块物质，它与细胞主核着色一致，圆形或椭圆形。常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)或外周血细胞进行微核试验。PCE是红细胞成熟的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，微核容易辩认，PCE胞质含RNA染色与成熟红细胞易于区别，故为骨髓微核试验的首选细