梅毒检测技术与质量考评

2014.6.4沈阳市CDC刘娜梅毒检测技术及质量考评目录一、梅毒的概述二、梅毒的实验室检测技术三、梅毒血清学质量考评总结一、梅毒的概述一、梅毒的概述1、定义梅毒（Syphilis）是梅毒螺旋体（Treponemapallidum，TP）（即苍白螺旋体的苍白亚种）感染人体所引起的一种系统性、慢性、经典的性传播疾病，可引起人体多系统、多脏器的损害，产生多种多样的临床表现，导致组织破坏、功能失常，甚至危及生命。是世界卫生组织所列的世界上50种常见传染病之一。是我国卫生部规定的8种重点防治的性病之一。《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病。人间传染的病原微生物名录：危害程度第三类，样本在生物安全二级实验室中检测。2、生物学特性一、梅毒的概述2.1形态细长，5-15×0.1-0.2um，形似细密的弹簧，螺旋弯曲规则整齐，平均8～14个，两端尖直，折光性强，一般染料不易着色，姬姆萨染色则可染成桃红色。2.2培养梅毒螺旋体是厌氧、寄生性微生物，在体内可长期生存繁殖，一般不能人工培养。1981年Fieldsteel等采用棉尾兔单层上皮细胞在微氧（1.5%氧）条件下培养，经9-12天孵育后，螺旋体数比接种数平均增加49倍，对兔仍保持毒力。一、梅毒的概述2、生物学特性2.3生存条件干燥、肥皂水及一般消毒剂如1：1000苯酚、新洁尔灭、稀酒精均可于短时间将其杀死温度的影响：41-42℃时可生活1-2小时，在48℃仅半小时即失去感染力，100℃立即死亡。对寒冷抵抗力大，在0℃时，可生活48小时，在低温（-78℃）保存数年，仍可保持其形态、活动及毒性在血液中4℃经3日可死亡，故在血库冰箱冷藏3日以上的血液就无传染性在封存的生理盐水稀释的组织液中可生活10小时左右在潮湿的器具或湿毛巾中，亦可生存数小时在干燥环境中可见迅速死亡一、梅毒的概述2、生物学特性2.4宿主梅毒螺旋体只感染人类人是梅毒的唯一传染源2.5抗原分为三类：密螺旋体抗原即梅毒螺旋体表面特异性抗原：刺激机体产生特异的凝集抗体及密螺旋体制动抗体或溶解抗体，后者加补体可溶解螺旋体螺旋体内类属抗原：可产生补体结合抗体，与非病原性螺旋体有交叉反应非螺旋体抗原即磷脂类抗原：当螺旋体侵入组织后，组织中的磷脂可粘附在螺旋体上，形成复合抗原，此种复合抗原可刺激机体产生抗磷脂的自身免疫抗体，称为反应素，可与牛心肌或其他正常动物心肌提取的类脂质抗原起沉淀反应（康氏试验）或补体结合反应（华氏试验）一、梅毒的概述3、传播途径3.1性接触主要传播途径，占95%以上。感染梅毒的早期传染性最强。感染后的头2年最具传染性，随着病期的延长传染性越来越小，感染后4年以上性接触的传染性十分微弱3.2胎传患有梅毒的孕妇可通过胎盘传染给胎儿，引起胎儿宫内感染，可导致流产、早产、死胎或分娩梅毒儿。一般认为孕妇梅毒病期越早，对胎儿感染的机会越大。孕妇即使患有无症状的隐性梅毒还具有传染性3.3间接接触包括其他非性接触的传染方式，较少见。如接触有传染性损害患者的日常用品如浴巾、内衣等。引起后天梅毒。一、梅毒的概述4、梅毒分期一期梅毒潜伏期2-4周，硬下疳和(或)腹股沟淋巴结肿大约1～3个月无症状的隐伏期后进入第二期二期梅毒梅毒螺旋体由局部经淋巴结进入血液，在人体内大量播散后而出现全身表现，一般发生在感染后8～12周或硬下疳出现后6～8周，病期在2年以内有多形性皮疹、扁平湿疣等三期（晚期）梅毒可有一期或二期梅毒史，病期在2年以上,约30%～40%未经治疗的梅毒患者可发生各种活动性晚期梅毒，包括树胶肿性梅毒，心血管梅毒，神经梅毒隐性（潜伏）梅毒无临床症状，梅毒血清反应阳性，无其他可引起梅毒血清反应阳性的疾病存在，脑脊液正常。早期：病期在2年以内；晚期：病期在2年以上。无任何梅毒性症状和体征胎传（先天）梅毒胎儿在母体内通过血源途径感染所致，不发生硬下疳，常有较严重的内脏损害。早期：在2岁前发生；晚期：在2岁以后发病。胎传隐性梅毒：未经治疗，无临床表现，但梅毒血清反应阳性一、梅毒的概述5、防治原则梅毒是一种性病，预防的主要措施是加强卫生宣传教育和社会管理目前尚无疫苗预防对病人应早诊、早治，现多采用青霉素3个月～1年，以血清中抗体阴转为治愈指标二、梅毒的实验室检测技术梅毒实验室检测病原检测抗体检测暗视野、镀银、核酸非梅毒螺旋体抗原血清试验梅毒螺旋体抗原血清试验VDRL、USR、RPR、TRUSTTPHA、TPPA、FTA-ABS、ELISA、TP-WB二、梅毒的实验室检测二、梅毒的实验室检测1、梅毒螺旋体病原学检测暗视野显微镜检查法镀银染色法直接免疫荧光法二、梅毒的实验室检测是目前国内主要的梅毒病原学诊断方法。适用于对一期梅毒及二期梅毒早期的检测。阳性可确诊，阴性不能排除梅毒诊断（螺旋体数量不足,已用过抗生素或某些外用药,损害接近自然消退）暗视野显微镜检查法二、梅毒的实验室检测2、梅毒血清试验(1)非梅毒螺旋体抗原血清试验(非特异性)(2)梅毒螺旋体抗原血清试验(特异性)根据检测所用抗原不同，梅毒血清学试验分为两大类：二、梅毒的实验室检测(1)、非梅毒螺旋体抗原血清试验所有非梅毒螺旋体抗原血清试验的抗原基本成分都是一样（心磷脂，卵磷脂，胆固醇）抗原抗体结合形成复合物，凝集成网状沉淀颗粒被肉眼所见敏感性高而特异性较低，且易发生生物学假阳性目前一般作为筛选和定量试验，观察疗效，复发及再感染二、梅毒的实验室检测(1)、非梅毒螺旋体抗原血清试验性病研究实验室试验（VenerealDiseaseResearchLaboratorytest，VDRL）；用心磷脂、卵磷脂及胆固醇为抗原，缺点：抗原每天配制；血清标本加热灭活；结果在显微镜下观察不加热血清反应素玻片试验（UnheatedSerumReagin，USR）也是VDRL抗原的改良，敏感性及特异性与VDRL相似，仍需显微镜下观察快速血浆反应素试验（RapidPlasmareagintest，RPR）：是VDRL抗原的改良，敏感性及特异性与VDRL相似，加入特制黑色碳颗粒，可肉眼读出结果，血清不需要灭活，不需要显微镜观察结果，可做定量试验甲苯胺红不加热血清试验（Toluidinereduntreatedserumtest，TRUST）：原理和成分与RPR试验相同，用红色的甲苯胺红替代了碳颗粒，其余特点均与RPR相同二、梅毒的实验室检测快速血浆反应素试验（RPR）1、仪器：水平旋转仪2、定性试验：加样：吸取0.05ml血清（浆）放在卡片圈中，并均匀地涂布在整个圈内加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1滴抗原反应：将卡片置水平旋转仪旋转8分钟，立即在亮光下观察结果3、定量试验：稀释液准备：在圈内加入50μl生理盐水（根据需要确定稀释度），勿将盐水涂开加样：吸取50μl血清（浆）与各圈中盐水作系列稀释，并涂布整个圈内下同定性试验二、梅毒的实验室检测RPR检测注意事项RPR试剂使用前要充分混匀标本在卡片上要涂开加入RPR试剂后要充分混旋3分钟内尽快观察结果二、梅毒的实验室检测RPR检测结果判读滴度：出现凝集反应的血清最高稀释倍数RPRTRUST二、梅毒的实验室检测临床意义非梅毒螺旋体抗原血清试验方法简单、快速、敏感性和特异性较好。适用于大量人群的筛查。早期梅毒硬下疳出现1周-2周后，血清可呈阳性。经充分治疗后，反应素可以消失。未经治疗的病人，其血清内的反应素可长期存在。可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征阳性时应结合病史、临床症状综合判断，并用梅毒螺旋体试剂盒确证特点二、梅毒的实验室检测梅毒血清假阳性反应技术性假阳性反应：如实验室操作错误，标本溶血等，如重复试验，无梅毒患者血清试验成为阴性。生物学假阳性反应：因非螺旋体抗原血清试验是非特异性的，在其它一些疾病，尤以感染性疾病，也可释放心拟脂至血液中，产生反应素，如麻风、麻疹、疟疾、传染性肝炎、病毒性肺炎、传染性单核细胞增多症，系统性红斑狼疮，非典型性肺炎、甚至妊娠都可出现阳性，但这类患者血清反应滴度低，很少超过1：8。而且半年内渐转成阴性。另外可用特异性的梅毒血清反应证实。二、梅毒的实验室检测假阴性反应在梅毒螺旋体感染后1～2周内可呈阴性反应梅毒螺旋体感染不久即开始治疗晚期梅毒患者的血清中反应素含量低，敏感性低的梅毒血清试验易出现阴性反应在二期梅毒时RPR试验也可出现阴性反应，前带现象(prozonephenomenon)二、梅毒的实验室检测前带现象指非梅毒螺旋体抗原血清试验中，有时由于血清抗体水平过高，抗原抗体比例不合适，而出现弱阳性、不典型或阴性的结果，但临床上又典型的二期体征，将此血清稀释后再做血清实验，出现了阳性结果，称为“前带现象”1%-2%二期梅毒患者因此现象而发生梅毒血清假阴性反应。二、梅毒的实验室检测(2)、梅毒螺旋体抗原血清试验用活的或死的梅毒螺旋体或其成分来作抗原测定抗螺旋体抗体敏感性和特异性均高，一般用作确证试验检测血清中抗梅毒螺旋体IgG抗体，即使患者经过足够治疗，仍能长期存在，甚至终身不消失，血清反应仍持续存在阳性，不能用于观察疗效二、梅毒的实验室检测(2)、梅毒螺旋体抗原血清试验梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)梅毒酶联免疫吸附试验（ELISA）梅毒免疫层析法-梅毒快速检测(RT)荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）化学发光免疫分析法（CLIA）梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB）二、梅毒的实验室检测(2)、梅毒螺旋体抗原血清试验FTA-ABS间接荧光抗体技术较敏感和较特异的试验，公认为金标准FITC标记的抗人抗体步骤多，对照多，结果判定需要经验原理：将完整的梅毒螺旋体作为抗原，加上经吸收剂(用Reiter螺旋体制备而成)处理过的梅毒血清或免疫血清，再加入荧光素(FTTC)标记的抗人免疫球蛋白，形成发荧光的抗原抗体复合物。在荧光显微镜下，螺旋体显出苹果绿色的荧光，即为阳性反应。二、梅毒的实验室检测(2)、梅毒螺旋体抗原血清试验TPPA敏感性和特异性均高，操作简便TPPA取代TPHA明胶颗粒取代红细胞用于抗原的致敏，不需要吸收过程非特异性凝集少对板、枪头要求较高原理：用超声裂解梅毒螺旋体抗原致敏明胶颗粒，此致敏颗粒与待测血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生肉眼可见的凝集反应，敏感性和特异性均高。明胶粒子为洋红色，在操作部步上也较为简便，出结果较快二、梅毒的实验室检测TPPA原理示意图赛乐迪亚（Serodia）TPPA诊断试剂盒TPPA二、梅毒的实验室检测TPPA赛乐迪亚（Serodia）TPPA的操作步骤二、梅毒的实验室检测TPPA赛乐迪亚（Serodia）TPPA结果判读TP-ELISA二、梅毒的实验室检测(2)、梅毒螺旋体抗原血清试验TP-ELISA试验是用重组梅毒螺旋体抗原包被固相板条，加上梅毒血清和单克隆抗体酶标记物，形成抗原抗体复合物与酶标记物结合，用酶联检测仪判定试验阳性反应本法可用于大规模血清检测。二、梅毒的实验室检测(2)、梅毒螺旋体抗原血清试验梅毒免疫层析法-梅毒快速检测(RT)二、梅毒的实验室检测梅毒血清学结果的解释RPR＋，FTA/TPPA－RPR假阳性RPR＋，FTA/TPPA＋现症梅毒RPR－，FTA/TPPA＋极早期梅毒,以往感染过梅毒，早期梅毒治疗后，部分晚期梅毒RPR－，FTA/TPPA－排除梅毒感染,极早期梅毒(尚无任何抗体产生)二、梅毒的实验室检测血清学检测的几个特点在最初的两周可能是阴性结果FTA、TPPA和ELISA在所有阶段都最敏感VDRL和RPR在三期梅毒期可能为阴性VDRL-CSF仅用于诊断神经性梅毒二、梅毒的实验室检测梅毒的诊断——WS273-2007确诊病例项目流行病学临床表现非梅毒螺旋体抗原血清学实验梅毒螺旋体抗原血清学实验其它检测一期高危行为一期阳性阳性暗视野阳性二期高危行为一期史，2年内阳性阳性暗视野阳性三期高危行为一、二期史二年以上阳性阳性脑脊液VDRL/ＦＴＡ－ＡＢＳ三期病理隐性高危行为无症状和体征阳性1：8阳性脑脊液无异常胎传生母梅毒存在相关临床表现阳性4倍母亲，反之不能排除阳性暗视野阳性二、梅毒的实验室检测梅毒血