SN∕T 5108-2019 国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒四联HRMA检测方法

书书书犐犆犛１１．１００犆６２中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜５１０８—２０１９国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒四联犎犚犕犃检测方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狉狅狋犪狏犻狉狌狊，犪狊狋狉狅狏犻狉狌狊，狀狅狉狅狏犻狉狌狊犪狀犱狊犪狆狅狏犻狉狌狊犫狔狇狌犪犱狉犻狆犾犲狓犎犚犕犃犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋狊２０１９０９０３发布２０２００３０１实施中华人民共和国海关总署发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国拱北海关，深圳市计量质量检测研究院。本标准主要起草人：汪海波、莫秋华、杨泽、兰全学、杨国武、史咏梅、涂承宁、林继灿。Ⅰ犛犖／犜５１０８—２０１９国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒四联犎犚犕犃检测方法１　范围本标准规定了国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒和札如病毒这四种病毒的检验对象、方法、结果报告、生物安全要求及阳性结果判定。本标准适用于入出境人员携带轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒的实验室检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室生物安全通用要求ＷＳ／Ｔ２３０　临床诊断中聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的应用ＳＮ／Ｔ１１９３　基因检验实验室技术要求ＳＮ／Ｔ１７２０　出入境口岸轮状病毒感染监测规程人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部２００６年制定）３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１　轮状病毒　犚狅狋犪狏犻狉狌狊属于呼肠孤病毒科（犚犲狅狏犻狉犻犱犪犲）轮状病毒属（犚狅狋犪狏犻狉狌狊），其基因组由１１个不连续的双链ＲＮＡ基因片段组成，分别编码６种结构蛋白（ＶＰ１～ＶＰ４，ＶＰ６、ＶＰ７）和６种非结构蛋（ＮＳＰ１～ＮＳＰ６）。轮状病毒有７个血清组（Ａ～Ｇ），其中Ａ、Ｂ、Ｃ组能引起人和动物腹泻。３．２　星状病毒　犃狊狋狉狅狏犻狉狌狊属于星状病毒科（犃狊狋狉狅狏犻狉犻犱犪犲）哺乳类星状病毒属（犕犪犿犪狊狋狉狅狏犻狉狌狊），为单股正链ＲＮＡ病毒，基因组长约６．８ｋｂ，从５’端到３’端包括一个约８５个核苷酸的５’非编码区（５’ｎｏｎｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ，ＮＣＲ），三个开放读码框架ＯＲＦ１ａ、ＯＲＦ１ｂ和ＯＲＦ２，一个约８０个核苷酸的３’非编码区和一个大约３０个核苷酸的多聚腺苷酸尾。星状病毒是引起婴幼儿、老年人、免疫功能低下或缺失者急性腹泻的重要病原体。３．３　诺如病毒　犖狅狉狅狏犻狉狌狊诺瓦克样病毒　犖狅狉狑犪犾犽犾犻犽犲狏犻狉狌狊犲狊诺沃克样病毒　犖狅狉狑犪犾犽犾犻犽犲狏犻狉狌狊犲狊属于杯状病毒科（犆犪犾犻犮犻狏犻狉犻犱犪犲）诺如病毒属（犖狅狉狅狏犻狉狌狊），为单股正链ＲＮＡ病毒，基因组长约７．６ｋｂ，包括３个开放阅读框（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｓ，ＯＲＦｓ）ＯＲＦｓ１、ＯＲＦｓ２和ＯＲＦｓ３。诺如病毒可分为５个型，分别为ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶ和ＧＶ，其中ＧＩ、ＧＩＩ和ＧＩＶ感染人，是引起成人和婴幼儿急性非细菌１犛犖／犜５１０８—２０１９性胃肠炎的重要病原体，全世界范围内均有流行，全年均可发生感染。３．４　扎如病毒　犛犪狆狅狏犻狉狌狊属于杯状病毒科（犆犪犾犻犮犻狏犻狉犻犱犪犲），为单股正链ＲＮＡ病毒，核酸序列长约７．５ＫＢ，包括２个开放读码框，ＯＲＦ１和ＯＲＦ２。ＳＶ可分为５个遗传型，即ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶ和ＧＶ，除ＧＩＩＩ型感染猪外，其他四型均感染人。３．５　高分辨率熔解曲线分析技术　犺犻犵犺狉犲狊狅犾狌狋犻狅狀犿犲犾狋犻狀犵犪狀犪犾狔狊犻狊；犎犚犕犃利用最新一代饱和荧光染料，实现分辨率高达０．０１℃的熔解曲线精确分析的技术。相对于传统的ＰＣＲ技术或实时荧光ＰＣＲ技术而言，操作步骤大大简化，而且无需使用昂贵的探针，时间和成本也降低了不少，并且样品经ＰＣＲ扩增后直接进行ＨＲＭＡ分析，无需转移，真正实现了闭管操作，降低了污染的风险。４　缩略语下列缩略语适用于本文件：———ｂｐ：ｂａｓｅｐａｉｒ，碱基对；———ＤＥＰＣ：ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ，焦碳酸乙二酯；———ＨＲＭＡ：ｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｍｅｌｔｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ，高分辨率熔解曲线分析；———ＰＡＧＥ：ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，聚丙烯酰胺凝胶电泳。５　检测对象５．１　出入境口岸发现的有呕吐、腹泻和发热等症状疑似腹泻病毒感染的急性肠胃炎病人。５．２　其他申请检验的人员。６　生物安全和犘犆犚防污染要求实验室生物安全应符合ＧＢ１９４８９的规定。按照《人间传染的病原微生物名录》，这四种病毒的危害程度均为第三类，可在生物安全二级实验室进行相关操作。ＰＣＲ防污染措施按ＷＳ／Ｔ２３０和ＳＮ／Ｔ１１９３的规定执行。７　主要仪器本方法所用的主要仪器如下：———二级生物安全柜；———台式高速冷冻离心机（最高离心力１２０００ｒｐｍ以上）；———旋涡振荡器；———冰箱：４℃、－２０℃和－７０℃；———超净工作台；———微型离心机；———ＲｏｔｏｒＧｅｎｅＱＰＣＲ热循环仪（带高分辨率熔解曲线分析模块）；注：给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的２犛犖／犜５１０８—２０１９效果，则可使用这些等效产品。———电子天平（犱＝１ｍｇ）；———微波炉；———高压灭菌锅；———超纯水器或双蒸水器；———微量可调移液器一套（含以下５种规格：２．５μＬ、２０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、１ｍＬ）。８　主要试剂８．１　无ＲＮＡ酶的ＤＥＰＣ水。８．２　ＲＴＰＣＲ引物应为ＰＡＧＥ以上级别纯化，引物序列见９．２．３．１。８．３　ＲＴＰＣＲ基础试剂：宝生物工程（大连）有限公司ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＯｎｅＳｔｅｐＲＴＰＣＲＫｉｔ。注：给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。８．４　ＥｖａＧｒｅｅｎ荧光染料。９　检验程序９．１　样品采集粪便标本和呕吐物标本的采集按照ＳＮ／Ｔ１７２０执行。９．２　实验室检验９．２．１　样品预处理取黄豆大小约１００ｍｇ的粪便标本或呕吐物，或１００μＬ水样便，加入９００μＬ的生理盐水，剧烈振荡混匀，制成１０％的悬液；然后４℃，８０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；转移上清至灭菌的干净离心管。不能立即进行检测时，样本冻存于－７０℃超低温冰箱备用。９．２．２　病毒核酸提取９．２．２．１　犜狉犻狕狅犾法取９．２．１预处理好的样本１００μＬ，加入１ｍＬＴｒｉｚｏｌ液，振荡混匀后室温静置５ｍｉｎ，然后加入２００μＬ氯仿，盖紧离心管，用手剧烈振荡混匀１５ｓｅｃ后室温静置５ｍｉｎ，４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上层水相至另一离心管中，加入５００μＬ异丙醇沉淀ＲＮＡ，充分混匀后室温放置１０ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液，再加入１ｍＬ的７０％乙醇洗涤一次，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清液，室温放置５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ后加入５０μＬＤＥＰＣ水（或其他核酸溶解液）溶解核酸沉淀，分装后于－７０℃条件下保存，备用。９．２．２．２　试剂盒提取核酸法按适用于病毒基因组提取的商品试剂盒说明书操作。９．２．３　四重高分辨率熔解曲线检测９．２．３．１　引物引物序列分别见表１。３犛犖／犜５１０８—２０１９表１　引物序列轮状病毒５’ＧＧＧＧＴＣＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＡＧＴＲＣＴＴＧＣＳＧＡ３’５’ＧＧＧＧＴＣＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＴＣＹＣＴＶＧＡＴＧＧＴＧＡＡＴＡＧＴＴＡＧＴＲＡＴ３’正向反向星状病毒５’ＧＧＧＧＴＣＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＧＣＡＴＴ３’５’ＧＧＧＧＴＣＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＣＴＧＴＧＡＣＡＣＣＹＴＧＴＴＴＣＣＴＧＡ３’正向反向诺如病毒５’ＧＧＧＧＴＣＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＡＣＡＧＡＴＡＣＣＡＣＴＡＴＧＡＴＧＣＡＧＡＹＴＡ３’５’ＧＧＧＧＴＣＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＣＡＡＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＡＲＡＡＲＧＡ３’正向反向扎如病毒５’ＧＧＧＧＴＣＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＣＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＲＡＷＧＣＢＴＧＧＴＴ３’５’ＧＧＧＧＴＣＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＣＧＧＲＣＹＴＣＡＡＡＶＳＴＡＣＣＢＣＣＣＣＡ３’正向反向　　注：简并碱基中Ｒ为Ａ或Ｇ；Ｓ为Ｃ或Ｇ；Ｙ为Ｃ或Ｔ；Ｖ为Ａ或Ｃ或Ｇ；Ｗ为Ａ或Ｔ；Ｂ为Ｇ或Ｔ或Ｃ。９．２．３．２　标准品、阳性对照、阴性对照和空白对照设置检测过程中分别设标准品、阳性对照、阴性对照和空白对照。标准品为克隆的轮状病毒、星状病毒、诺如病毒和札如病毒部分核苷酸序列（必须包含扩增区域在内）在体外转录合成的ＲＮＡ；阳性对照为留存的这４种病毒的阳性样本的核酸或体外转录合成的ＲＮＡ；阴性对照为正常人大便提取的核酸；空白对照为无菌水。９．２．３．３　反应体系组成反应体系组成见表２。表２　反应体系组成组分体积２×ｏｎｅｓｔｅｐＲＴＰＣＲＢｕｆｆｅｒ１０μＬＲＴＰＣＲＥｎｚｙｍｅＭｉｘ０．４μＬ轮状病毒正反向引物（２０μＭ）各０．２５μＬ星状病毒正反向引物（２０μＭ）各０．１μＬ诺如病毒正反向引物（２０μＭ）各０．１２μＬ扎如病毒正反向引物（２０μＭ）各０．１８μＬ２０×ＥｖａＧｒｅｅｎ１μＬＲＮＡ模板４μＬＤＥＰＣ水３．３μＬ总体积２０μＬ　　注：如果其他商品化试剂盒具有相同的效果，亦可使用。９．２．３．４　反应条件反应条件为：４２℃反转录５ｍｉｎ；９５℃预变性１０ｓｅｃ；９５℃变性１０ｓｅｃ，６０℃退火／延伸３０ｓｅｃ，４０个循环；设置温度从６５℃逐渐上升至９５℃，上升速率为０．１℃／ｃｙｃｌｅ。因不同ＰＣＲ仪器的性能差异，４犛犖／犜５１０８—２０１９可根据条件优化适当调整反应条件。９．２．３．５　高分辨率熔解曲线分析用仪器自带的软件对生成的熔解曲线进行分析，将阳性对照／阴性对照／空白对照／样本的熔解曲线同标准品的熔解曲线进行对比。阳性样本的曲线为典型的单一尖峰，而阴性样本的曲线为均一直线，无熔解峰。９．２．４　检验结果判断及报告当阳性对照的熔解曲线同各标准品的一致，而阴性对照／空白对照的为均一直线时才可对样本进行结果判断及报告，否则视为实验失败，需重新实验。本标准检验结果判断及报告如下：ａ）　检验样品的熔解曲线同轮状病毒标准品的一致，报告“检出轮状病毒特异性基因（ＨＲＭＡ法）”；ｂ）　检验样品的熔解曲线同星状病毒标准品的一致，报告“检出星状病毒特异性基因（ＨＲＭＡ法）”；ｃ）　检验样品的熔解曲线同诺如病毒标准品的一致，报告“检出诺如病毒特异性基因（ＨＲＭＡ法）”；ｄ）　检验样品的熔解曲线同扎如病毒标准品的一致，报告“检出扎如病毒特异性基因（ＨＲＭＡ法）”；ｅ）　检验样本的熔解曲线同空白对照的一致，即为均一直线时，报告“未检出轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒特异性基因（ＨＲＭＡ法）”。５犛犖／犜５１０８—２０１９