SN∕T 4544.2-2022 商品化试剂盒检测方法 菌落总数 方法二

ICS07.100.30CCSC53中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4544.2—2022商品化试剂盒检测方法菌落总数方法二Commercialkitmethod—Aerobiccount—TestmethodⅡ2022-03-14发布2022-10-01实施中华人民共和国海关总署发布前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件是SN/T4544《商品化试剂盒检测方法菌落总数》的第2部分。SN/T4544已经发布了以下部分:———商品化试剂盒检测方法菌落总数方法一;———商品化试剂盒检测方法菌落总数方法二。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国福州海关。本文件主要起草人:郑晶、林杰、郭菁、肖颖、陈彬、董健、柯璐、徐珊、张温玲、戴晓丽。ⅠSN/T4544.2—2022商品化试剂盒检测方法菌落总数方法二1范围本文件规定了食品中两种3M菌落总数测试片(3MPetrifilmTMAerobicCountPlate和3MPetri-filmTMRapidAerobicCountPlate)的检测方法。本文件适用于食品中菌落总数的测定。该方法不适于米粉等10倍稀释后流动性不强的食品;不适于10倍稀释后色度较深的食品。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.2食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27405实验室质量控制规范食品微生物检测SN/T2775商品化食品检测试剂盒评价方法SN/T3266食品微生物检验方法确认技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4生物安全措施为了保护实验室人员的安全和防止污染,应由具备资格的工作人员检测菌落总数。所有培养物和废弃物应按照GB19489和GB/T27405中的有关规定执行。5技术概要菌落总数测试片(3MPetrifilmTMAerobicCountplate)是一种预先制备好的培养基系统,其培养基为标准的平板计数琼脂(PCA)培养基,并且含菌落指示剂,菌落在测试片上呈红色,这样可增强菌落计数效果。菌落总数测试片(3MPetrifilmTMRapidAerobicCountPlate)是一种预先制备好的培养基系统,包含营养成分、冷水可溶性凝胶及双联指示剂技术,菌落在测试片上呈红色和蓝色,24h即可对食品基质进行菌落计数。1SN/T4544.2—20226仪器和设备除微生物实验室常规灭菌和培养设备外,其他设备和材料如下:6.1恒温培养箱:36℃±1℃,30℃±1℃。6.2冰箱:2℃~5℃。6.3恒温水浴箱:46℃±1℃6.4天平:感量为0.1g。6.5均质器。6.6振荡器。6.7无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度),10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。6.8无菌锥形瓶:容量为250mL、500mL。6.9无菌培养皿:直径为90mm。6.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。6.11放大镜或/和菌落计数器。6.123M压板。7试剂和材料7.1菌落总数测试片:本文件使用的测试片3MPetrifilmTMAerobicCountPlate和3MPetrifilmTMRapidAerobicCountPlate由3M有限公司生产,参考SN/T2775和SN/T3266,按商品化食品检测试剂盒评价程序进行评价,评价结果参见附录A和附录B。7.2磷酸盐缓冲液(PBS):按附录C中C.1。7.3无菌生理盐水:按附录C中C.2。7.41mol/L氢氧化钠(NaOH):称取40gNaOH溶于1000mL蒸馏水中。7.51mol/L盐酸(HCl):移取90mL浓盐酸,用蒸馏水稀释至1000mL。8检测程序菌落总数测试片检测程序见图1。2SN/T4544.2—2022图1菌落总数测试片检测方法程序9操作步骤9.1样品制备和稀释9.1.1按照GB4789.2的方法制备1∶10样品匀液。无菌操作调节该样品匀液的pH为6.6~7.2,酸性样液用1mol/L氢氧化钠(NaOH)调节,碱性样液用1mol/L盐酸(HCl)调节,或根据产品标准规定的酸碱溶液来调节pH值。9.1.2按照GB4789.2方法吸取1∶10样品匀液,制备10倍系列稀释样品匀液。9.2接种9.2.1根据对样品污染情况的估计,选择2个~3个适宜稀释度样品匀液进行检验,根据需要选择3MPetrifilmTMAerobicCountPlate测试片或3MPetrifilmTMRapidAerobicCountPlate测试片。9.2.2将菌落总数测试片置于平坦表面处,揭开上层膜,吸取某一稀释度的1mL样品匀液,垂直滴加在测试片的中央处,然后将上层膜轻轻放下,将压板放置在上层膜中央处,轻轻的压下,使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上,切勿扭转压板。拿起压板,静置至少1min以使培养基凝固。9.2.3每个稀释度接种两张测试片。同时,分别吸取1mL空白稀释液加入两张测试片内作空白对照。3SN/T4544.2—20229.3培养9.3.13MPetrifilmTMAerobicCountPlate培养将测试片的透明面朝上,水平置于培养箱内,可堆叠至20片。在36℃±1℃条件下培养48h±2h,水产品30℃±1℃培养72h±3h。9.3.23MPetrifilmTMRapidAerobicCountPlate培养在36℃±1℃条件下培养24h±2h;如有产品标准等特殊要求,则按相应的标准或要求进行。9.4菌落计数9.4.13MPetrifilmTMAerobicCountPlate计数9.4.1.1到培养时间应立即计数,选取菌落数在30CFU~300CFU之间的测试片计数菌落总数,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。9.4.1.2计数所有红色菌落。如果无法确定红点是菌落还是红色食品基质,可以延长培养24h后观察。如果红点变大则确定是菌落,如果红点未变大则确定是基质。9.4.1.3当细菌浓度很高时,整个测试片会变成红色,将结果记录为“多不可计”(toonumeroustocount,TNTC)。9.4.1.43MPetrifilmTMAerobicCountPlate有20个等分格,当菌落数量过多,计数困难时,可选择几个有代表性菌落的小方格,计算平均菌落数,再乘以相应倍数,即可得到整个测试片上的估算菌落数。9.4.1.5一些微生物会液化凝胶,造成局部扩散或菌落模糊的现象。如果液化现象干扰计数,可以计数未液化的面积来估算菌落浓度。9.4.23MPetrifilmTMRapidAerobicCountPlate计数9.4.2.1到培养时间应立即计数,选取菌落数在30CFU~300CFU之间的测试片计数菌落总数,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。9.4.2.2计数所有蓝色和红色菌落。如果无法确定红点是菌落还是红色食品基质,可以延长培养24h后观察。如果红点变大则确定是菌落,如果红点未变大则确定是基质。9.4.2.3当细菌浓度很高时,整个测试片会变成红色或蓝色,将结果记录为“多不可计”(toonumeroustocount,TNTC)。9.4.2.43MPetrifilmTMRapidAerobicCountPlate有30个等分格,当菌落数量过多,计数困难时,可选择几个有代表性菌落的小方格,计算平均菌落数,再乘以相应倍数,即可得到整个测试片上的估算菌落数。9.4.2.5一些微生物会液化凝胶,造成局部扩散或菌落模糊的现象。如果液化现象干扰计数,可以计数未液化的面积来估算菌落浓度。10结果和报告菌落总数的计算方法和菌落总数报告的规则按照GB4789.2。4SN/T4544.2—2022附录A(资料性)菌落总数测试片(3MPetrifilmTMAerobicCountPlate)评价结果A.1线性和准确度见表A.1和表A.2。表A.1测试片方法和参考方法(GB4789.2—2016)的线性关系食品种类食品基质线性方程相关系数(R2)T检验值肉类冻鸡肉y=0.804x+0.67380.94240.927熟鸡肉y=0.9174x+0.28580.93050.412鱼类和海产品丁香鱼y=1.0175x+0.05550.99190.582旗鱼松y=1.012x+0.07190.95260.340冻带鱼y=0.9264x-0.14630.98952.494水果和蔬菜制品萝卜丝y=0.8784x+0.34290.96700.221沙拉y=0.6211x+0.82570.97130.189青豆y=1.0472x-0.04880.98190.192乳制品纯牛奶y=1.0122x+0.06370.95500.382婴儿奶粉y=0.9975x+0.0340.96470.108全脂奶粉y=0.9849x+0.08910.98680.086杂品馅饼y=1.0406x-0.38210.96891.072面条y=0.8267x+0.15350.89720.733咖喱粉y=0.9842x+0.04340.99200.015绿茶y=0.9742x+0.23440.99520.510T0.05(15)=2.131表A.25类食品的线性关系食品种类Log值范围线性方程相关系数(R2)肉类1.00~3.26y=0.8269x+0.56590.9236鱼类和海产品0~3.75y=0.9458x+0.06580.9492水果和蔬菜制品0.30~3.86y=1.2509x-0.54740.9354乳制品1.00~5.20y=0.9919x+0.07470.9831杂品1.00~3.96y=0.9251x+0.23220.9195所有食品y=0.9973x+0.04850.9364注:y为测试片法菌落数的对数值;x为参考法菌落数的对数值。5SN/T4544.2—2022A.2耐变性选用两个污染水平的奶粉样品对培养温度和培养时间两个变量进行耐变性试验,经验证,培养温度选择35℃和37℃,培养时间选择46h和50h,对检测结果的标准偏差与在重复性条件下得到的标准偏差没有明显差别,表明说明书中对培养温度为36℃±1℃和培养时间为48h±2h的耐变性范围不影响检测结果。见表A.3。表A.3耐变性试验结果实验条件菌株添加水平测试结果12345平均值Sr37℃,50h高浓度3.363.303.363.333.303.330.029低浓度2.302.302.302.402.402.340.05337℃,46h高浓度3.393.323.343.393.393.370.034低浓度2.302.302.362.322.322.320.02535℃,50h高浓度3.363.353.363.343.363.350.008低浓度2.302.342.382.322.262.320.04735℃,46h高浓度3.303.343.393.343.363.350.034低浓度2.342.342.342.362.362.350.011A.3批间变异取3个不同批号的测试片对两个污染浓度奶粉样品进行批间变异实验,3个不同批号测试片测试结果的标准偏差与在重复性条件下得到的标准偏差没有明显差别,说明不同批号产品无明显差异。见表A.4。表A.4批间变异试验结果菌株浓度批号测定结果12345MeanSrRSD高浓度2013-02-TU3.403.383.383.383.383.380.010.30%2013-02-TB3.343.383.323.363.403.360.030.89%2013-02-