SN∕T 1632.4-2022 出口乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测方法 第4部分：PCR-C

ICS67.050CCSX16中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1632.4—2022出口乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测方法第4部分:PCR-CRISPR法TestmethodofCronobacterspp.(Enterobactersakazakii)inexportmilkpowder—Part4:PCR-CRISPRmethod2022-03-14发布2022-10-01实施中华人民共和国海关总署发布前言本文件按照GB/T1.1—2020和GB/T20001.4—2015的规定起草。本文件是SN/T1632《出口乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测方法》的第4部分。SN/T1632已经发布了以下部分:———第1部分:分离与计数;———第2部分:PCR方法;———第3部分:荧光PCR方法;———第4部分:PCR-CRISPR法。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国上海海关、上海市质量监督检验技术研究院、深圳大学第一附属医院、大连民族大学。本文件主要起草人:杨捷琳、刘洋、张清平、薛俊欣、杨娟、张懿翔、袁辰刚、李林显、蒋原、王金、郭德华、王越、申进玲、曲勤凤、郑秋月、张奕南、赵磊。ⅠSN/T1632.4—2022出口乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测方法第4部分:PCR-CRISPR法1范围本文件规定了乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)(Cronobacterspp.)的PCR-CRISPR检测方法。本文件适用于乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)(Cronobacterspp.)的定性检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.40食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1Cas蛋白CasproteinCas蛋白是指CRISPR-associated蛋白,它是CRISPR系统中起功能作用的相关蛋白。3.1.2Cas12b酶Cas12benzymeCas蛋白的一种,属于II类V-b型Cas蛋白,是crRNA:tracrRNA(sgRNA)依赖的核酸内切酶。3.1.3向导RNAguideRNA向导RNA是指引导Cas蛋白特异性结合靶标DNA序列的RNA,通常由crRNA或crRNA:tracrRNA(sgRNA)复合物组成。3.1.4N值NvalueCRISPR方法检测结果的判定值。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。CRISPR:成簇的规律间隔的短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicre-peats)tracrRNA:反式激活CRISPRRNA(trans-activationCRISPRRNA)1SN/T1632.4—20224方法提要本文件通过PCR-CRISPR方法对乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)开展定性检测。首先采用普通PCR进行克罗诺杆菌属fusA基因特异性扩增,再用CRISPR反应特异性切割扩增产物,观察荧光值增量并给出结果判定。CRISPR/Cas12b是基因编辑系统中的一种,其对应的tracrRNA和crRNA通过碱基互补配对方式形成RNA复合结构,该结构与Cas12b结合形成复合物,如果有目标DNA存在,Cas12b蛋白在crRNA:tracrRNA引导下特异性结合靶标核酸,之后其非特异性切割单链DNA的活性被激活,从而将体系中单链DNA报告分子切开并释放出可检测的信号。5试剂和材料除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682一级水的要求。所有试剂均用无DNA/RNA酶污染的容器分装。5.1缓冲蛋白胨水(BPW)。5.2裂解液:20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/LEDTA,pH调至8.0。5.3TE缓冲液:1mmol/LTris-HCl,0.1mmol/LEDTA,pH8.0。5.4蛋白酶K:20mg/mL。5.5Tris饱和酚。5.6三氯甲烷。5.7异戊醇。5.8乙醇。5.92×PCR缓冲液:Phanta􀆿MaxBuffer。5.10dNTP混合液(10mM)。5.11DNA聚合酶。5.12NEBuffer:100mMNaCI,50mMTris-HCI,10mMMgCl2,100ug/mlBSA,pH7.9。5.13RNA酶抑制剂。5.14TaqMan实时荧光PCR预混液:TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液、氯化镁、dNTPs(含dATP、dUTP、dCTP、dGTP))和UNG酶按比例配制的溶液。5.15检测用引物和探针PCR扩增及CRISPR反应所用引物、crRNA和探针序列详见表1。表1克罗诺杆菌属引物、crRNA与探针引物/探针序列(5’→3’)靶基因碱基数(bp)引物F5’AACACGCTTTCTAACGTTGATAAGG3’引物R5’CTTTTGTCGTAAGAGCAGAGGTGAG3’crRNA5’CGAGCGAUCUGAGAAGUGGCACAUAAGGCCAAUAAUAAUG3’fusAa252540Cas12b-tracrRNA5’GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAAA3’—48探针5’FAM-nnnnnnnnnnnn-Eclipse3’—12PCR扩增产物长度65bpa靶序列参见附录B。2SN/T1632.4—20226仪器和耗材6.1PCR仪。6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.3恒温水浴锅。6.4离心机:离心力≥13000g。6.5微量移液器:0.5μL~10μL,10μL~100μL,20μL~200μL,200μL~1000μL。6.6涡旋震荡器。6.7荧光定量PCR仪或其他可检测荧光的设备。6.8恒温培养箱。7试样制备7.1增菌培养按照GB4789.40的方法进行样品制备和一次增菌,样品污染浓度较低时可进行二次增菌。取检样100g置灭菌锥形瓶中,加入900mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水(参见附录A),用手缓缓地摇动至充分溶解,36℃±1℃培养18h±2h。7.2DNA提取采用下述方法提取DNA,也可使用等效的商品化DNA提取试剂盒提取制备模板DNA。对于7.1获得的增菌液,采用如下方法制备模板DNA:吸取1mL增菌液加入1.5mL离心管中,12000g离心3min,弃上清;加入1mL0.85%无菌生理盐水,完全溶解沉淀,12000g离心3min,弃上清;加入100μL无菌水混匀后沸水浴10min,置冰上冷却;12000g离心12min,上清液即为模板DNA。8细菌基因组DNA的提取纯化8.1增菌液4℃留存。8.2取2mL增菌液,置于5mL离心管中,13400g离心2min,弃上清,向沉淀中加入400μL裂解液,20μL蛋白酶K,56℃振荡2h,13400g离心5min。8.3转移上清液到新的离心管中,加入与上清液等体积的酚/三氯甲烷/异戊醇(25∶24∶1,体积比)混合液振荡混匀,13400g离心10min,将上清液转移到新的离心管中,再次加入与上清液等体积的三氯甲烷/异戊醇(24∶1,体积比)溶液,振荡混匀,13400g离心10min,将上清液转移到新的离心管中。8.4加入2倍体积的预冷的无水乙醇溶液,混合均匀后室温放置20min,13400g离心2min,弃去上清液,加入1mL70%乙醇溶液洗涤沉淀2次,弃去乙醇溶液,将DNA晾干后,加入50μLTE溶液充分溶解,置于4℃条件下备用。8.5也可用等效试剂盒提取模板DNA。9PCR扩增9.1阴性对照、阳性对照和空白对照的设置9.1.1检测过程中分别设阴性对照、空白对照和阳性对照。3SN/T1632.4—20229.1.2空白对照以无菌水作为模板。9.1.3阴性对照以非克罗诺杆菌种属细菌DNA作为模板。9.1.4阳性对照以ATCC25944或等效标准菌株DNA作为模板。9.2反应体系反应体系配制见表2。每个样品设置2个平行。表2PCR反应体系试剂体积PCR反应混合液12.5μL正向引物(10μmol/L)1μL反向引物(10μmol/L)1μLDNA模板(5ng/μL)1μL灭菌ddH2O补足至25μL9.3反应参数95℃预变性5min;95℃20s,60℃20s,72℃10s,设30个循环;72℃延伸5min;4℃保存。注:不同型号仪器的使用可参考仪器使用操作说明。10CRISPR反应与荧光检测10.1CRISPR反应体系见表3。表3CRISPR反应体系试剂体积NEBuffer3.1(10×)2μLCas12b(5μM)1μLcrRNA(10μM)1μLtracrRNA(10μM)1μL探针(10μM)1μLRNA酶抑制剂(40U/μL)0.25μLPCR产物2μL灭菌ddH2O补足至20μL10.2仪器检测通道的选择48℃温度下,每1分钟检测1次FAM荧光(492nm~518nm),持续15min。11计算公式判定值N=(10min样品荧光值/10min对照荧光值)/(2min样品荧光值/2min对照荧光值),如4SN/T1632.4—2022公式(1)所示。判定值N=(SF10min/CF10min)(SF2min/CF2min)…………………………(1)式中:SF———样品荧光值。CF———对照荧光值。12质量控制12.1空白对照:无特异性扩增荧光增长。12.2阴性对照:无特异性扩增荧光增长,或N值低于1.20(cut-off值)。12.3阳性对照:有特异性扩增荧光增长,或N值高于1.40(cut-off值)。12.4空白对照和阴性对照有荧光增长时,实验视为无效。13检测结果判定和表述13.1N≥1.40时,判定在100g样品中检出克诺罗杆菌属(阪崎肠杆菌)fusA基因。13.2N≤1.20时,判定在100g样品中未检出克诺罗杆菌属(阪崎肠杆菌)fusA基因。13.3N在1.20~1.40之间,则重复实验一次。重复实验的比值1.20,则判定为检出克诺罗杆菌属(阪崎肠杆菌)fusA基因;重复实验的比值≤1.20,则判定为未检出克诺罗杆菌属(阪崎肠杆菌)fusA基因。13.4检出fusA基因的样品应进一步将留存的增菌液采用GB4789.40进行确证。14结果报告未检出fusA基因的阴性样品,报告100g样品中未检出克诺罗杆菌属(阪崎肠杆菌);fusA基因的阳性样品,经确证后按照确证结果报告100g样品中检出或未检出克诺罗杆菌属(阪崎肠杆菌)。15检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403—2008中附录D的规定执行。5SN/T1632.4—2022附录A(资料性附录)培养基和试剂A.1缓冲蛋白胨水(BPW)A.1.1成分蛋白胨1.0g氯化钠5.0g磷酸二氢钾1.5g磷酸氢二钠9.0g蒸馏水1000mLA.1.2制法加热搅拌至溶解,调至pH7.2±0.2,高压灭菌121℃,15min。6SN/T1632.4—2022附录B(资料性附录)克罗诺杆菌属fusA基因片段扩增靶标参考序列B.1克罗诺杆菌属fusA基因片段扩增靶标参考序列(NCBINo.CP011047.1)如图B.1所示。图B.1扩增靶标参考序列SN/T1632.4—20222202—4􀏕2361T/NS中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测方法第4部分:PCR-CRISPR法SN/T1632.4