T∕CPMA 023-2020 血中N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物的测定 液相色谱串联质谱法

ICS13.100CCSC52T/CPMA023—2020血中N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物的测定液相色谱串联质谱法DeterminationofN-methylcarbamoylatedhaemoglobininbloodbyliquidchromatography-tandemmassspectrometry2020-12-30发布2021-05-01实施中华预防医学会发布团体标准T/CPMA023—2020I前言本标准按照GB/T1.1-2020给出的规则起草。本标准由中华预防医学会提出并归口。本标准起草单位：苏州市疾病预防控制中心、杭州医学院、江苏省疾病预防控制中心、无锡市疾病预防控制中心、江苏康达检测技术股份有限公司。本标准主要起草人：王春民、吴春霞、张秋萍、刘强、钱亚玲、唐红芳、阮征、刘华良、朱峰、吴宇伉、刘文卫、付杰、李军、李建、沈强、杨海兵T/CPMA023—20201血中N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物的测定液相色谱串联质谱法1范围本标准规定了血中N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物的液相色谱串联质谱检测方法。本标准适用于接触二甲基甲酰胺的职业人群血中N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GBZ/T295职业人群生物监测方法总则3原理血红蛋白中的N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物（NMHb）经酸水解转化为3-甲基-5-异丙基乙内酰脲（MVH）后，经蛋白沉淀净化，液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）测定，以保留时间和特征离子及其丰度比定性，以定量特征离子的峰面积，用内标工作曲线法进行定量。4仪器及材料4.1肝素或乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝采血管：5mL。4.2具塞圆底离心管：15mL。4.3离心机：4000rpm。4.4真空离心浓缩仪。4.5涡旋混合器。4.6电热恒温水浴锅，±2℃。4.796孔板减压提取装置。4.896孔蛋白沉淀板（配收集板及盖板）：复合吸附型（40mg/2ml/well）或相当者。4.9天平：感量1mg和0.1mg。4.10液相色谱串联质谱仪，配电喷雾离子源。5试剂5.1超纯水。5.2甲醇（CH3OH）：色谱纯。5.3乙腈（C2H3N）：色谱纯。5.4盐酸（HCl，ρ=1.18g/cm³）：优级纯。T/CPMA023—202025.5冰醋酸（CH3COOH）：优级纯。5.6甲酸（HCOOH）：色谱纯。5.7氯化钠（NaCl）：分析纯。5.8氯化钾（KCl）：分析纯。5.9十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）：分析纯。5.10磷酸二氢钾（KH2PO4）：分析纯。5.11磷酸盐缓冲溶液：称取80g氯化钠、2g氯化钾、35.8g十二水磷酸氢二钠、2.4g磷酸二氢钾溶于1000mL水中。或可直接购买成品（PBS，10×）。5.123-甲基-5-异丙基乙内酰脲（MVH，CAS：74310-99-9）：标准物质或色谱纯试剂（纯度≥99.0%）。5.133-甲基-异丁基海因（MIH，CAS：675854-31-6）：标准物质或色谱纯试剂（纯度≥99.0%）。5.14甲醇溶液（1:1,v/v）：量取100mL甲醇加入到100mL水中。5.15盐酸醋酸溶液（2:1,v/v）：量取100mL冰醋酸加入到200mL盐酸中。5.16甲酸乙腈溶液（1:99,v/v）：吸取1mL甲酸加入到99mL乙腈中。5.17MVH标准储备溶液：称取0.0156gMVH，用甲醇溶液溶解并定容至50mL，该储备液浓度为2.0mmol/L。此溶液可在4℃冰箱中保存14d。5.18MIH内标储备液：称取0.0170gMIH，用甲醇溶液溶解并定容至50mL，该内标储备液浓度为2.0mmol/L。此溶液可在4℃冰箱中保存14d。5.19MIH内标工作液：临用前准确吸取MIH内标储备液1.0mL于50mL容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，该内标溶液浓度为40.0nmol/mL。6样品的采集、运输、制备和保存6.1样品采集、运输按GBZ/T295要求采集职业人群静脉全血2.5mL于采血管中，立即轻轻摇匀；采集未暴露于二甲基甲酰胺的健康人群血样，立即轻轻摇匀，作为空白血样。样品冷藏运输。6.2血红蛋白提取取2mL血样于15mL离心管中，以2000rpm离心15min。弃去上层，加入7.0mL水，轻轻振荡10s，立即加入1.0mL磷酸盐缓冲溶液，摇匀，以1000rpm离心5min。吸取上清液于另一15mL离心管中，得血红蛋白提取液。提取液在真空离心浓缩仪中（45℃）干燥至干，制成松散、无结块的血红蛋白粉末约300mg。未暴露于二甲基甲酰胺的健康人群血样，按上方法制备成空白血红蛋白。血液中血红蛋白提取应在24h内完成。6.3样品保存血红蛋白提取液密封后在4℃可保存3d，在-18℃可保存5d。干燥后血红蛋白粉末在-18℃可保存14d，在-80℃可保存30d。7分析步骤7.1仪器操作参考条件T/CPMA023—202037.1.1液相色谱参考条件a)色谱柱：BonshellC18Plus（3.0mm×50mm，2.7µm，100Å）或相当者；b)柱温：35℃；c)流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液；d)流速：0.25mL/min；e)进样量：5µL；f)流动相梯度洗脱条件见表1。表1流动相梯度洗脱条件时间/min流动相A/%流动相B/%0.0090101.2010903.0010903.5090104.0090107.1.2质谱参考条件a)电离方式：电喷雾电离（ESI），正离子模式；b)毛细管电压：3.5kV；c)源温度：150℃；d)脱溶剂气温度：350℃；e)脱溶剂气流速：800L/h；f)检测方式：多反应监测（MRM），监测参数见表2。表2多反应监测（MRM）参数化合物母离子子离子锥孔电压/V碰撞能量/V3-甲基-5-异丙基乙内酰脲157.172.0а3215129.132113-甲基-异丁基海因171.186.0а3015a为定量离子7.2工作曲线制备与测定各取适量MVH标准储备溶液，用甲醇溶液将其稀释成0nmol/mL~400nmol/mL的标准系列溶液。依次取100µL以上标准系列溶液，加入到各含有0.100g空白血红蛋白粉末的15mL圆底离心管中，然后各加入250µLMIH内标工作液，再各加入盐酸醋酸溶液4.65mL，立即涡旋混匀30s，将以上离心管置于95℃水浴中加热降解1h，取出冷却至室温，混匀后净化。取降解后溶液200µL上样到96孔蛋白沉淀板，加入600µL甲酸乙腈溶液，混匀后盖上盖板。控制真空泵压力使液滴流出速度不超过1mL/min，收集流出液，混匀；制备得到内标MIH含量为10.0nmol的MVH含量为0nmol~40nmol标准工作系列溶液。T/CPMA023—20204参照仪器操作条件，分别测定标准工作系列溶液；以标准工作系列溶液中MVH的含量为横坐标，以测得的MVH峰面积与内标MIH峰面积比值为纵坐标，绘制内标工作曲线。7.3样品处理称取0.1g（精确至0.001g）血红蛋白粉末置于15mL具塞圆底离心管中，加入250µLMIH内标工作液，再加入盐酸醋酸溶液4.75mL，立即涡旋混匀30s。将离心管置于95℃水浴中加热降解1h，取出冷却至室温，混匀后待净化。注：降解反应过程可能产生气泡，小心操作。取降解后溶液200µL上样到96孔蛋白沉淀板，加入600µL甲酸乙腈溶液，混匀后盖上盖板。控制真空泵压力使液滴流出速度不超过1mL/min，收集流出液，混匀后待测。7.4样品测定用测定标准系列溶液的操作条件测定样品和样品空白溶液。样品中待测组分保留时间与标准工作溶液中对应组分保留时间相同，定性离子的相对丰度与相当浓度标准工作溶液中定性离子相对丰度一致，且相对丰度允许偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在对应的化合物。表3定性确证相对离子丰度最大允许偏差相对离子丰度＞50%20%～50%（含）10%～20%（含）≤10%允许相对偏差±20%±25%±30%±50%根据得到的目标物峰面积，采用内标工作曲线法进行定量。若MVH的浓度超过测定范围，则应减少取样量重新处理后再进样测定。7.5质量控制检测过程质量控制按照GBZ/T295进行。8计算N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物（NMHb）转化成3-甲基-5-异丙基乙内酰脲（MVH）为等摩尔反应，故样品中N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物（NMHb）的浓度可按式（1）计算：c=nm………………………………………………（1）式中：c———样品中N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物（NMHb）的浓度，单位为纳摩尔每克血红蛋白（nmol/gHb）；n———根据工作曲线计算得到的样品中MVH的含量，单位为纳摩尔（nmol）；m———称取血红蛋白样品的重量，单位为克（g）。9说明9.1本法的检出限为0.05nmol/mL，定量下限为0.168nmol/mL，测定范围为0.168nmol/mL~8.0nmol/mL。（以0.1g血红蛋白粉末量计）血中N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物（NMHb）的最低检出浓T/CPMA023—20205度为2.5nmol/gHb，最低定量浓度为8.4nmol/gHb。方法批内精密度为1.4%~8.3%，批间精密度为0.8%~7.4%，回收率为82.1%~104.9%。9.2供仪器测定用样品溶液不宜低温冷藏（低温会有物质析出，影响测定结果），应当天完成检测。9.3空白血红蛋白中N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物（NMHb）浓度应低于最低检出浓度。9.4空白血红蛋白多反应监测色谱图见图1，血红蛋白样品多反应监测色谱图见图2。图1空白血红蛋白多反应监测色谱图T/CPMA023—20206图2血红蛋白样品多反应监测色谱图_________________________________