SNT 2221-2008 进出口动物源性食品中氮哌酮及其代谢产物残留量的检测方法 气相色谱-质谱法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２２２１—２００８进出口动物源性食品中氮哌酮及其代谢产物残留量的检测方法气相色谱质谱法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犪狕犪狆犲狉狅狀犲犪狀犱犻狋狊犿犲狋犪犫狅犾犻狋犲狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犳狊狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犌犆犕犛犿犲狋犺狅犱２００８１１１８发布２００９０６０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准进出口动物源性食品中氮哌酮及其代谢产物残留量的检测方法气相色谱质谱法ＳＮ／Ｔ２２２１—２００８中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张１．２５　字数３０千字２００９年２月第一版　２００９年２月第一次印刷印数１—２０００书号：１５５０６６·２１９４６０　定价１２．００元书书书前　　言本标准的附录Ａ和附录Ｂ均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李波、郭德华、王传现、卫锋、杨惠琴、林维宣、邓晓军、朱坚、韩丽。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２２２１—２００８进出口动物源性食品中氮哌酮及其代谢产物残留量的检测方法气相色谱质谱法１　范围本标准规定了动物源性食品中氮哌酮及其代谢产物氮哌醇残留量检测的气相色谱质谱测定方法。本标准适用于猪肉和猪肾中氮哌酮及其代谢产物氮哌醇残留量的测定和确证。２　方法提要试样用乙腈提取，经Ｃ１８ＳＰＥ柱净化，酸性乙腈洗脱，正己烷液液分配，叔丁基甲醚萃取后，氮哌醇再经硅烷化衍生，用气相色谱质谱法测定，内标法定量。３　试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。３．１　甲醇：液相色谱纯。３．２　正己烷：液相色谱纯。３．３　乙腈：液相色谱纯。３．４　乙酸乙酯：液相色谱纯。３．５　叔丁基甲醚：液相色谱纯。３．６　硫酸：９８％。３．７　氢氧化钠。３．８　氯化钠。３．９　１０％氯化钠溶液：称取１００ｇ氯化钠溶于适量水中，并用水定容至１Ｌ。３．１０　硫酸溶液：将２８ｍＬ硫酸（３．６）缓缓加入装有５００ｍＬ水的烧杯中，混匀冷却至室温备用。３．１１　０．０１ｍｏｌ／Ｌ硫酸溶液：移取２０ｍＬ硫酸溶液（３．１０）至装有２５０ｍＬ水的１Ｌ量杯中，加水至１Ｌ。３．１２　０．０５ｍｏｌ／Ｌ硫酸溶液：移取１００ｍＬ硫酸溶液（３．１０）至装有２５０ｍＬ水的１Ｌ量杯中，加水至１Ｌ。３．１３　酸性乙腈溶液：在１００ｍＬ乙腈中加入１ｍＬ０．０５ｍｏｌ／Ｌ硫酸溶液（３．１２）。３．１４　０．５ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液：称取２０ｇ氢氧化钠溶于适量水，并用水定容至１Ｌ。３．１５　乙腈饱和正己烷溶液：取１００ｍＬ正己烷，３０ｍＬ乙腈于分液漏斗中，振荡混匀，待用。３．１６　衍生化试剂：双三甲基硅基三氟乙酰胺（ＢＳＴＦＡ）三甲基氯硅烷（ＴＭＣＳ）（９９＋１，体积比）。３．１７　２，３，４２′，４′，５′六氯联苯（ＰＣＢ１３８）：纯度大于等于９８％。３．１８　内标溶液：用乙酸乙酯配制２，３，４２′，４′，５′六氯联苯（ＰＣＢ１３８）浓度为０．１０μｇ／ｍＬ。３．１９　氮哌酮标准品（Ａｚａｐｅｒｏｎｅ，ＣＡＳ号：１６４９１８９，分子式：Ｃ１９Ｈ２２ＦＮ３Ｏ）：纯度大于等于９８％。３．２０　氮哌醇（Ａｚａｐｅｒｏｌ，ＣＡＳ号：２８０４０５９，分子式：Ｃ１９Ｈ２４ＦＮ３Ｏ）标准溶液：１０μｓ／ｍＬ甲醇溶液，在－１８℃下避光保存。３．２１　氮哌酮标准储备溶液：准确称取适量氮哌酮标准品，用甲醇配制成浓度为１０μｇ／ｍＬ的标准储备液，在－１８℃下避光保存，有效期半年。１犛犖／犜２２２１—２００８３．２２　混合标准工作溶液：各准确移取０．５０ｍＬ氮哌醇标准溶液（３．２０）和氮哌酮标准储备溶液（３．２１）于１０ｍＬ棕色容量瓶并用甲醇定容，溶液浓度约为０．５μｇ／ｍＬ。在－１８℃下避光保存，有效期３个月。３．２３　Ｃ１８ＳＰＥ柱：ＳｅｐＰａｋＶａｃ１ｇ，６ｍＬ或相当者。４　仪器和设备４．１　气相色谱质谱仪：四极杆质谱仪，配有ＥＩ源并具有选择离子功能。４．２　分析天平：感量０．１ｍｇ和０．０１ｇ。４．３　旋涡混匀器。４．４　组织捣碎机。４．５　旋转蒸发器。４．６　固相萃取装置。４．７　离心机：转速不低于４０００ｒ／ｍｉｎ，配有１０ｍＬ和５０ｍＬ塑料离心管。４．８　氮气吹干仪。４．９　超声波水浴。５　试样制备与保存５．１　试样制备从所取全部样品中取出有代表性样品约５００ｇ，充分捣碎均质，均分成两份，分别装入洁净容器内。密封作为试样，标明标记。５．２　试样保存将试样于－１８℃以下保存。在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。６　测定步骤６．１　提取称取约５ｇ均匀试样（精确到０．０１ｇ），置于５０ｍＬ塑料离心瓶中，加２０ｍＬ乙腈，置于旋涡混匀器上涡旋混匀４５ｓ，再超声提取１０ｍｉｎ，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。吸取１０ｍＬ上层乙腈溶液至一已存放５０ｍＬ１０％氯化钠溶液（３．９）的玻璃瓶中，混匀，置０℃～４℃存放约０．５ｈ，待净化。６．２　净化将Ｃ１８ＳＰＥ柱（３．２３）安装到固相萃取装置上，用１０ｍＬ甲醇和１０ｍＬ水活化，加入上述提取液（６．１），控制流速２滴／ｓ，用１ｍＬ０．０１ｍｏｌ／Ｌ硫酸溶液（３．１１）淋洗，并排干柱中液体，再用３ｍＬ酸性乙腈溶液（３．１３）洗脱并收集于１０ｍＬ塑料离心管中，于４０℃下用氮气吹至约３００μＬ。立即加１ｍＬ乙腈饱和的正己烷（３．１５），并在旋涡混匀器上高速混匀３０ｓ后，４０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，弃去正己烷层，再加１ｍＬ乙腈饱和的正己烷重复操作一次。残留溶液加入１５０μＬ０．５ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液（３．１４），调节ｐＨ至１０，慢慢加入１ｍＬ叔丁基甲醚，旋涡混匀３０ｓ后，４０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，移取上层有机相至一玻璃小试管中，再用２×１ｍＬ叔丁基甲醚重复提取２次，合并提取液于３０℃下用氮气吹干。６．３　衍生化用２００μＬ甲醇溶解残渣并转移至衍生瓶中，再重复操作一次，合并溶液。同时吸取０μＬ、５０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、４００μＬ、８００μＬ混合标准使用溶液（３．２２）于另一系列衍生瓶中。同步把样品提取液和混合标准溶液在３０℃下用氮气吹干，加入１００μＬ衍生化试剂（３．１６），混匀，于７０℃烘箱内衍生２０ｍｉｎ，冷却后用氮气吹干，加１００μＬ内标溶液（３．１８）溶解残渣，供气相色谱质谱测定。２犛犖／犜２２２１—２００８６．４　测定６．４．１　气相色谱质谱条件ａ）　色谱柱：ＨＰ５ＭＳ，３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）×０．２５μｍ（膜厚），或相当者；ｂ）　升温程序：８０℃保持１ｍｉｎ，以２０℃／ｍｉｎ升至１９０℃（保持２ｍｉｎ），再以２０℃／ｍｉｎ升至２５０℃（保持１５ｍｉｎ）；ｃ）　载气：氦气，纯度≥９９．９９９％，流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ；ｄ）　进样口温度：２５０℃；ｅ）　进样方式：无分流进样，１．０ｍｉｎ后开阀；ｆ）　进样量：２μＬ～３μＬ；ｇ）　电离方式：ＥＩ，７０ｅＶ；ｈ）　接口温度：２８０℃；ｉ）　离子源温度：２３０℃；ｊ）　溶剂延迟：１３．５ｍｉｎ；ｋ）　测定方式：选择离子监测方式（ＳＩＭ）；ｌ）　监测离子：见表１。表１　氮哌酮和氮哌醇衍生物的监测离子及其丰度比名　　称监测离子（ｍ／ｚ）监测离子丰度比／％氮哌醇衍生物１０７（定量离子）、２９４、２０４、４０１１００∶２１∶１６∶７氮哌酮１０７（定量离子）、１２３、２３３、３２７１００∶３５∶２６∶７ＰＣＢ１３８内标３６０（定量离子）—６．４．２　气相色谱质谱测定根据样液中被测组分含量，选定浓度相近的标准工作溶液。其响应值均应在仪器检测的线性范围内。对标准工作溶液与样液等体积参插进样测定，以色谱峰面积按内标法定量。在上述色谱条件下，内标ＰＣＢ１３８、氮哌醇衍生物和氮哌酮的参考保留时间分别为１４．２ｍｉｎ、２０．２ｍｉｎ、２０．６ｍｉｎ，标准溶液的选择离子色谱图参见附录Ａ中图Ａ．１。６．４．３　气相色谱质谱确证在相同实验条件下，试样中待测物质的保留时间与标准工作溶液中对应的保留时间偏差在±２．５％之内；并且被测样液与标准品的质谱图相似，所选择的全部监测离子均出现；而且之间的丰度比也相一致，其允许偏差不超过表２规定的范围时，则可确定为样品中存在这种药物残留。标准品的质谱图参见附录Ｂ中图Ｂ．１和图Ｂ．２。表２　定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度／％＞５０＞２０～５０＞１０～２０≤１０允许的相对偏差／％±１０±１５±２０±５０６．５　空白试验除不加试样外，均按上述操作步骤进行。７　结果计算和表述用色谱数据处理机或按式（１）计算样品中氮哌酮和氮哌醇残留量。计算结果需扣除空白值。犡犻＝犮ｓ×犮′×犃犻×犃′ｓ×犞犮′ｓ×犃′×犃ｓ×犿……………………………（１）３犛犖／犜２２２１—２００８　　式中：犡犻———试样中氮哌酮或氮哌醇残留量，单位为毫克每千克（ｍｇ／ｋｇ）；犮ｓ———标准工作溶液中氮哌酮或氮哌醇的浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犮′———样液中内标物的浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犃犻———样液中氮哌酮或氮哌醇的峰面积；犃′ｓ———标准工作溶液中内标物的峰面积；犞———样液最终定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犮′ｓ———标准工作溶液中内标物的浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犃′———样液中内标物的峰面积；犃ｓ———标准工作溶液中氮哌酮或氮哌醇的峰面积；犿———最终样液代表的试样质量，单位为克（ｇ）。本方法氮哌酮的残留量测定结果系指氮哌酮和氮哌醇残留量之和。８　测定低限和回收率８．１　测定低限本方法测定低限：０．０１ｍｇ／ｋｇ。８．２　回收率８．２．１　猪肉添加水平为０．０１０ｍｇ／ｋｇ时，氮哌酮回收率为７２．０％～１０７％；氮哌醇回收率为６８．０％～１０３％。添加水平为０．０５０ｍｇ／ｋｇ时，氮哌酮回收率为７６．８％～１０６％；氮哌醇回收率为７０．４％～９６．８％。添加水平为０．１００ｍｇ／ｋｇ时，氮哌酮回收率为７６．０％～１０８％；氮哌醇回收率为７２．４％～１０３％。８．２．２　猪肾添加水平为０．０１０ｍｇ／ｋｇ时，氮哌酮回收率为７２．０％～１０８％；氮哌醇回收率为６８．０％～１０６％。添加水平为０．０５０ｍｇ／ｋｇ时，氮哌酮回收率为７８．４％～１０６％；氮哌醇回收率为６８．８％～９８．４％。添加水平为０．１００ｍｇ／ｋｇ时，氮哌酮回收率为７１．２％～１０５％；氮哌醇回收率为７０．０％～１０１％。４犛犖／犜２２２１—２００８附　录　犃（资料性附录）标准品选择离子色谱图　　１———ＰＣＢ１３８；２———氮哌醇衍生物；３———氮哌酮。图犃．１　氮哌醇标准品衍生物、氮哌酮标准品的选择离子色谱图５犛犖／犜２２２１—２００８附　录　犅（资料性附录）标准品质谱图图犅．１　氮哌醇标准品衍生物的全扫描质谱图图犅．２　氮哌酮标准品的全扫描质谱图６犛犖／犜２２２１—２００８犉狅狉犲狑狅狉犱犃狀狀犲狓犃犪狀犱犪狀狀犲狓犅狅犳狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犻狊犪狀犻狀犳狅狉犿犪狋犻狏犲犪狀狀犲狓．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊狆狉狅狆狅狊犲犱犫狔犪狀犱犻狊狌狀犱犲狉狋犺犲犮犺犪狉犵犲犱狅犳犮犲狉狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱犪犮犮狉犲犱犻狋犪狋犻狅狀犪犱犿犻狀犻狊狋犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犘犲狅狆犾犲’狊犚犲狆狌犫犾犻犮狅犳犆犺犻狀犪．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊犱狉犪犳狋犲犱犫狔犛犺犪狀犵犺犪犻犈狀狋狉狔犈狓犻狋犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犅狌狉犲犪狌狅犳狋犺犲犘犲狅狆犾犲’狊犚犲狆狌犫犾犻犮狅犳犆犺犻狀犪，犔犻犪狅狀犻狀犵犈狀狋狉狔犈狓犻狋犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱犙狌犪狉犪