基层培训-免疫学技术

第五章常用免疫学检验技术临床免疫检验是运用免疫学基本的基本原理和技术，检查临床标本中的微生物抗原、肿瘤抗原以及相应的微生物抗体、自身抗体，为感染性性疾病、肿瘤、自身免疫病以及免疫缺陷提供诊断依据。免疫检验分为两个部分，一部分为利用免疫检测原理检测免疫活性细胞、抗原、抗体、补体、细胞因子、细胞粘附分子等免疫相关物质，另一部分是利用免疫检测原理检测体液中微量物质如激素、酶、血浆微量蛋白、血液药物浓度、微量元素等。这些检测结果为临床上确定诊断、分析病情、调整治疗方案和判断预后等提供了有效的实验依据。第一节免疫学检验原理、特点和方法一、免疫学检验原理（一）抗原抗体反应是抗原与相应抗体之间的特异性结合反应。它既可发生在体内，也可发生在体外。在体内发生的抗原抗体反应即为体液免疫应答的效应作用。体外的抗原抗体结合反应，根据参与反应的抗原的物理性状（可溶性或颗粒性）以及参与反应的条件（电解质、补体等）不同，表现出不同的现象，如沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合和毒素中和等。一般将检查血清中病原微生物抗原和抗体的试验称为血清学试验。抗原抗体反应可分为两个阶段。第一阶段为特异性结合阶段，此阶段仅需数秒至数分钟，但并不出现可见的反应；第二阶段为可见反应阶段，这一阶段抗原抗体复合物在适当的电解质、pH、温度和补体等的影响下，进一步交联聚集，出现凝集、沉淀、溶解和补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。第二阶段反应较慢，往往需要数分钟至数小时。这两个阶段不能严格划分，所需的时间也受多种因素的影响。（二）抗原抗体反应的特点：1、特异性抗原抗体反应的特异性（specificity）是指抗原分子上的抗原决定簇和抗体分子超变区结合的特异性，由这两个分子之间空间结构的互补性决定的。形同钥匙与锁一样，所以抗原抗体的结合是有高度特异性的。例如白喉抗抗毒素只能与相应的外毒素结合，而不能与破伤风外毒素结合。因此，在抗原抗体反应的免疫学实验中，可以用已知的抗原或抗体来检测特定的相对应的抗体或抗原。2、比例性比例性（proportionality）是指抗原与抗体特异性结合反应时，生成肉眼可见结合物的量与反应物浓度的关系，只有当二者浓度比例适当时，才出现可见反应。抗原抗体分子比例合适的范围，称为抗原抗体反应的等价带。在此范围抗原抗体结合充分，沉淀物形成得快而多。在等价带的前后，由于抗体和抗原的过量，上清液中可测出游离的抗体或抗原，形成的沉淀物少。当抗体过量时，称为前带，抗原过量时称为后带。因此，在抗原抗体反应的试验中，如果没有产生肉眼可见的抗原抗体复合物出现，一方面要考虑是否有抗原与相应的抗体存在，另一方面还必须注意到两者反应的比例是否适当。3、可逆性抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体的特性称为抗原抗体结合的可逆性（reversibility）。由于抗原抗体的结合是分子表面的非共价键结合，故形成的复合物是不牢固的，在一定的条件下可以解离，所以说抗原抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一动态平衡过程。抗原抗体复合物解离取决于两方面的因素：一是抗体对相应抗原的亲和力；二是环境因素对复合物的影响。亲和力高的抗体与抗原表位在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不容易解离，反之，亲和力低的抗体与抗原形成的复合物较易解离。环境因素中的过高或过低均可破坏离子间的静电引力，使抗原抗体的结合力下降。增加离子强度，也可使静电引力消失，降低抗原抗体的结合力，促使其解离。解离后的抗原和抗体仍然保持游离抗原、抗体的生物活性。（三）影响抗原抗体反应的因素影响抗原抗体反应的因素较多，主要有两方面：一是反应物自身的因素，另一方面是反应环境的因素。1、反应物自身因素（1）抗原抗原的理化性状、表面抗原决定簇的种类和数目均可影响抗原抗体反应的结果。如颗粒性抗原与相应抗体结合后产生凝集现象；可溶性抗原与相应抗体结合后产生沉淀现象；单价抗原与相应抗体结合后不出现沉淀现象。（2）抗体①来源来源于不同动物的免疫血清，其反应性有差异。家兔等大多数动物的免疫血清，由于具有较宽的等价带，与相应抗原结合易出现可见的抗原抗体复合物。马、人的免疫血清等价带窄，抗原不足或过剩，均易形成可溶性复合物。单克隆抗体一般不适合用于凝集和沉淀反应。②浓度抗体的浓度往往是与抗原相对而言，二者合适的浓度才易出现可见的反应结果。③特异性和亲和力特异性与亲和力是影响抗原抗体反应的关键因素，它们共同影响试验结果的准确程度。诊断试剂应尽可能选高特异性、高亲和力的抗体，才能提高试验的可靠性。2、反应的环境条件（1）电解质抗原抗体结合后，由亲水性向疏水性转换过程中必须要有电解质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失去电荷，破坏水化层，使复合物相互靠拢聚集，形成大块凝集、沉淀。若无电解质存在，则不出现可见反应。在抗原抗体反应中，通常使用0.85%NaCl溶液或各种缓冲液作抗原抗体的稀释液及反应液。（2）酸碱度抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行，pH过低或过高都会影响抗原抗体的反应。抗原抗体反应中一般以pH6～9为宜。有补体参与的反应pH为7.2～7.4，超过这个范围会降低补体的酶活性而影响反应。（3）温度抗原抗体反应需要合适的温度才有利于二者结合。一般以15～40℃为宜，最适温度为37℃。在此范围内，温度越高，抗原抗体分子运动越快，碰撞接触机会越多，两者结合反应速度越快。但是如果温度高于56℃，会导致抗原抗体复合物解离，甚至分子变性。温度越低，反应速度越缓慢，但抗原抗体结合越牢固，易于观察。（4）振荡在抗原抗体反应中，适当的振摇可促使抗原抗体分子的接触，加速其反应。（四）抗原抗体反应的类型随着免疫学技术的飞速发展，在原有经典免疫学实验方法基础上，新的免疫学测定方法不断出现，使免疫学实验技术更特异、更敏感和更稳定。目前根据抗原和抗体的性质不同，反应出现的现象和结果的不同，以及反应时参与的其他条件不同，将抗原抗体反应分为五种类型。（1）可溶性抗原与相应抗体结合产生的沉淀反应；（2）颗粒抗原与相应抗体结合发生的凝集反应；（3）抗原抗体结合后激活补体所产生的溶细胞反应；（4）细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应；（5）标记免疫的抗原抗体反应。每种反应类型都包括若干实验技术。（见抗原抗体反列应表1）表1抗原抗体反应的类型和试验方法----------------------------------------------------------------------------------------反应类型实验方法结果判断---------------------------------------------------------------------------------------沉淀反应液相沉淀实验观察沉淀、检测浊度琼脂凝胶扩散观察和测定扫描沉淀线或环凝胶电泳技术观察和测定扫描沉淀峰弧等凝集反应直接凝集实验用裸眼、放大镜或显微镜观察红细胞或胶乳颗粒的凝集现象间接凝集实验同上凝集抑制实验同上协同凝集实验同上抗球蛋白实验同上-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------补体参与反应补体溶血实验以裸眼或光电比色仪观察测定溶血现象补体结合实验同上中和反应病毒中和实验病毒感染性丧失毒素中和实验外毒素毒性丢失标记免疫荧光免疫技术检测荧光放射免疫技术检测放射性酶标免疫检测酶底物显色、发光、荧光发光免疫技术检测发光金标免疫技术观察金颗沉淀线---------------------------------------------------------------------------------------二、免疫学检验方法和应用（一）凝集反应颗粒性抗原或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒后，与相应抗体（或抗原）发生特异性反应，在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应。凝集试验应用广而且敏感度高，方法简便，迄今已成为通用的免疫学技术之一，广泛用于细菌的鉴定和分型、抗原分析、测定抗体和诊断疾病等临床检验。在免疫检验技术中，根据参与反应的颗粒的不同，把凝集反应分为直接凝集反应和间接凝集反应。而自身红细胞凝集反应试验和抗球蛋白参与的凝集试验是两种特殊的凝集反应。1、直接凝集反应：细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体反应，当二者比例适当时，出现凝集，称为直接凝集反应。反应中的抗原称为凝集原，参与反应的抗体称为凝集素。常用的凝集试验有玻片法、试管法和微量血凝反应板法。（1）玻片凝集试验：多用于定性。用以知抗体诊断血清与受检菌液在玻片上混匀，放置数分钟后如抗体与相应抗原反应即出现肉眼可见的凝集反应。如沙门菌玻片凝集试验。（2）试管凝集试验：多用于半定量和定量试验，常用已知一定量的抗原（细菌、细胞等）与一系列稀释的病人血清混合，在保温放置后观察结果，判定受检血清有无相应抗体以及效价，如肥达反应。2、间接凝集反应：将可溶性抗原（或抗体）先吸附或偶联与免疫无关大小适当的颗粒表面，使之成为致敏载体颗粒，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在条件下，出现特异性的凝集现象，称为间接凝集反应。其敏感度比直接凝集反应高2～8倍，亦明显高于沉淀反应。在临床上广泛用于各种抗体和可溶性抗原的检测。间接凝集反应试验可分为：（1）间接凝集试验：用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体。将可溶性抗原与载体颗粒结合，再与样品中的抗体反应，形成肉眼可见的凝集颗粒或凝集块者为阳性。（2）反向间接凝集试验：用已知特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原。临床上用于检测HbsAg、AFP等。（3）间接抑制试验：试剂为已知抗原致敏的颗粒载体和相应的抗体，用于检测标本中与致敏抗原相同的抗原。检测方法是将标本与抗体试剂混合反应，然后加入致敏载体，若出现凝集，说明标本中不存在相应抗原，抗体试剂未被结合，仍与载体上的抗原反应；如未出现凝集，则说明标本中含有相应抗原，凝集反应被抑制。（4）协同凝集试验：其原理同反向间接凝集试验，但所用的载体是金黄色葡萄球菌，其细胞壁中有A蛋白（SPA），SPA具有能与特异性抗体IgG的Fc段结合的特性。当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏的颗粒载体，若与相应抗原接触，就会出现反向间接凝集反应，常用于细菌、病毒、毒素及可溶性抗原的快速检测。①间接血凝试验：是以红细胞作为载体的间接凝集试验。可根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱。在临床检测中应用广泛，是经典的抗原抗体反应之一。②胶乳凝集试验：是以聚苯乙烯胶乳微粒为载体的间接凝集试验。③明胶凝集试验：即以明胶颗粒为载体的间接凝集试验。常用于血清中抗病毒抗体的检测。间接凝集试验的应用间接凝集试验具有敏感、快速、操作简便和不需要特殊仪器等优点，既可以检测抗原，又可以检测抗体。已广泛应用于医学检验。特别是对某些疾病的诊断治疗和效果的观察有着重要的参考价值。（1）抗体的检测用于检测微生物、寄生虫等感染所产生的抗体及自身抗体和药物抗体。如检测沙门菌抗体和类风湿因子等。（2）抗原的检测用于在临床上用反向间接凝集试验检测甲胎蛋白抗原和乙型肝炎病毒流行病学调查。在妇产科常用胶乳凝集试验检测孕妇尿中的绒毛膜促性腺激素（HCG）抗原。以诊断早期妊娠。（二）沉淀反应沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体在适当的条件下发生特异性结合而产生沉淀的现象。沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖等可溶性物质。抗原与相应抗体再介质中或固相表面发生特异性结合，可分为两个阶段，第一阶段为抗原抗体特异性结合反应，在几秒或几十秒内就可完成，出现可溶性小附和物，十分快速，但肉眼不可见。在免疫比浊法中可以测定免疫复合物形成的速率，称为速率比浊法。第二阶段则形成大的可见的免疫复合物，