GBT 38261-2019 纳米技术 生物样品中银含量测量 电感耦合等离子体质谱法

书书书犐犆犛７１．０４０．４０犃４３中华人民共和国国家标准犌犅／犜３８２６１—２０１９纳米技术　生物样品中银含量测量电感耦合等离子体质谱法犖犪狀狅狋犲犮犺狀狅犾狅犵狔—犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狊犻犾狏犲狉犮狅狀狋犲狀狋狊犻狀犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾狊犪犿狆犾犲狊—犐狀犱狌犮狋犻狏犲犾狔犮狅狌狆犾犲犱狆犾犪狊犿犪犿犪狊狊狊狆犲犮狋狉狅犿犲狋狉狔２０１９１２１０发布２０２００７０１实施国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会发布书书书目　　次前言Ⅲ…………………………………………………………………………………………………………引言Ⅳ…………………………………………………………………………………………………………１　范围１………………………………………………………………………………………………………２　规范性引用文件１…………………………………………………………………………………………３　术语和定义１………………………………………………………………………………………………４　缩略语１……………………………………………………………………………………………………５　原理１………………………………………………………………………………………………………６　仪器与试剂１………………………………………………………………………………………………７　样品２………………………………………………………………………………………………………８　试验步骤３…………………………………………………………………………………………………９　数据分析４…………………………………………………………………………………………………１０　准确度和精密度４…………………………………………………………………………………………１１　测试报告５…………………………………………………………………………………………………附录Ａ（资料性附录）　实验流程图６………………………………………………………………………附录Ｂ（资料性附录）　测试报告模板８……………………………………………………………………附录Ｃ（资料性附录）　含有银包金纳米棒的生物组织中银含量的测量示例９…………………………参考文献１３……………………………………………………………………………………………………Ⅰ犌犅／犜３８２６１—２０１９前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中国科学院提出。本标准由全国纳米技术标准化技术委员会（ＳＡＣ／ＴＣ２７９）归口。本标准起草单位：国家纳米科学中心、中国食品药品检定研究院、北京市理化分析测试中心、国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心。本标准主要起草人：吴美玉、刘颖、李瑞如、王新胜、柳琳、高峡、赵婷、陈宽、淡墨、陈亮、徐丽明、谢黎明。Ⅲ犌犅／犜３８２６１—２０１９引　　言　　银纳米颗粒具有广谱的抗菌活性，广泛应用于生活用品以及医疗器械中［１，２］。随着应用范围的不断扩大，银纳米颗粒进入人体的途径更加多样化，并以多种形式存在于生物组织中。因此，银暴露的风险引起了高度关注。在银纳米颗粒的毒代动力学等生物效应和安全性评价中，银纳米颗粒暴露后，可以以颗粒、离子等多种形式存在于生物样品中，而不同形式的银元素均在其生物学功能中发挥重要作用，所以准确测量生物样品中银元素的总含量非常重要。但是，目前尚无相关国家标准。电感耦合等离子体质谱法（ＩＣＰＭＳ）是以等离子体为离子源的一种质谱型元素分析方法，主要用于进行多种元素的同时测定，适用于痕量或微量重金属元素的分析［３～５］。本标准包括经银纳米颗粒暴露的生物样品的微波消解方法，以及使用ＩＣＰＭＳ测量消解后样品中银元素总含量的方法。Ⅳ犌犅／犜３８２６１—２０１９纳米技术　生物样品中银含量测量电感耦合等离子体质谱法警示———本标准方法中使用的部分试剂具有腐蚀性和强氧化性，需谨慎防护，避免接触皮肤和衣物；微波消解过程应在通风橱内进行，按仪器相关设备安全规定操作；注意安全用电。１　范围本标准规定了生物样品中银含量的定量测量方法，包括样品制备和测量步骤。本标准适用于多种生物样品（生物组织、细胞、３Ｄ组织模型等）中银含量的定量测量。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ１９６１９　纳米材料术语ＧＢ／Ｔ３０９０３　无机化工产品　杂质元素的测定　电感耦合等离子体质谱法（ＩＣＰＭＳ）３　术语和定义ＧＢ／Ｔ１９６１９和ＧＢ／Ｔ３０９０３界定的术语和定义适用于本文件。４　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＩＣＰＭＳ：电感耦合等离子体质谱（ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙｃｏｕｐｌｅｄｐｌａｓｍａｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）５　原理生物样品经微波消解后定容，所得溶液采用ＩＣＰＭＳ方法进行元素含量检测。定量方法采用内标法，即在待测样品、空白样品和加标样品中通过蠕动泵在线加入相同浓度的内标元素，根据银元素的强度与内标元素强度值的比值和银元素浓度的定量关系实现对银的定量分析。该方法中设置加标样品以判定测量结果的准确性。６　仪器与试剂６．１　仪器６．１．１　电感耦合等离子体质谱分析仪（ＩＣＰＭＳ分析仪）。６．１．２　微波消解仪：具备程式化功率设定功能，最大输出功率≥１２００Ｗ，最高设定温度≥１９５℃。１犌犅／犜３８２６１—２０１９６．１．３　消解罐：压力消解罐，聚四氟乙烯材质或等效材质，５５ｍＬ。６．１．４　聚四氟乙烯管：１５ｍＬ。６．１．５　赶酸仪：工作温度范围为室温至２００℃。６．１．６　分析天平：灵敏度０．１ｍｇ。６．１．７　移液器：量程２．５μＬ，量程１０μＬ，量程２００μＬ，量程１０００μＬ。６．１．８　冰箱：可满足－２０℃冷冻存储条件。６．２　试剂除非另有说明，分析时均使用确认为优级纯或以上级别的化学试剂，实验用水为符合ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水，标准溶液使用有证标准物质。６．２．１　硝酸：ρ＝１．４２ｇ／ｍＬ。６．２．２　银标准溶液：介质１．０ｍｏｌ／Ｌ硝酸。６．２．３　内标标准溶液：介质１．０ｍｏｌ／Ｌ硝酸。宜选用铟（１１５Ｉｎ）和铑（１０３Ｒｈ）为内标元素，内标元素的选择原则参考ＧＢ／Ｔ３０９０３。６．２．４　氩气：纯度≥９９．９９％。７　样品７．１　样品前处理流程图参见附录Ａ中图Ａ．１。７．２　待测生物样品制备７．２．１　将冷冻的待测生物样品室温解冻，差量法准确称取一定量的样品（犿Ｔ，宜为０．１００ｇ～０．５００ｇ）至５５ｍＬ微波消解罐中。新鲜获得的样品可直接称量。注１：对于总质量不足０．１００ｇ的生物样品，可以实际称量质量为准。注２：体外３Ｄ模型生物样品直接将收集的样品投入消解罐即可，可不称量；体外２Ｄ细胞经胰酶消化、离心收集入离心管后，在离心管中加入１ｍＬ浓硝酸预消解过夜，然后转移至消解罐，进行微波消解步骤。７．２．２　在上述每个微波消解罐中加入１０ｍＬ浓硝酸，预消解３０ｍｉｎ。７．２．３　旋紧消解罐，将其对称安装在转盘上进行微波消解。微波消解参考程序见表１。注：不同微波消解仪可根据仪器固有条件适当调整功率和消解时间等程序参数，保证样品消解完全即可。表１　生物样品微波消解参考程序１步骤功率／Ｗ升温时间／ｍｉｎ温度／℃保持时间／ｍｉｎ１１６００８１２０２２１６００８１６０５３１６００８１９５５０７．２．４　待消解程序结束，取出消解罐冷却至室温。７．２．５　旋开消解罐，使消解过程产生的气体缓慢释放，观察并确定样品是否完全消解。若消解完全，则执行步骤７．２．６。若消解液中仍有油脂小液滴，则参考表２中的程序继续消解，直至消解完全。２犌犅／犜３８２６１—２０１９表２　生物样品微波消解参考程序２步骤功率／Ｗ升温时间／ｍｉｎ温度／℃保持时间／ｍｉｎ１１６００８１２０２２１６００１６１９５３０７．２．６　将消解液在赶酸仪上加热赶酸至近干，宜在１６０℃加热约９０ｍｉｎ，取出消解罐冷却至室温。７．２．７　将７．２．６中的消解液转移至已称量的１５ｍＬ聚四氟乙烯管中，然后用体积分数为１％的稀硝酸洗涤消解罐２次～３次，将全部洗涤液转移至上述聚四氟乙烯管，并称量定容至１０．０００ｇ～１５．０００ｇ（犿１）用于银含量测量。７．２．８　移取７．２．７中的消解液各１ｍＬ至离心管，室温差量法精确称量并记录该１ｍＬ溶液的质量（犿２，精确至１ｍｇ），用于数据分析。７．３　空白加标样品制备空白加标样品用来评价系统方法回收率。根据预实验生物样品中的银含量数据，确定在空白样品中加入银标准溶液的量。要求至少设置低、中、高银含量的三组空白加标样品，且此范围包含待测生物样品中的银含量。以实验用水代替标准银溶液，按以上相同步骤制备全程序空白溶液。注：一般情况下，低、中、高组可设置为０．１０μｇ、１．００μｇ、１０．０μｇ三组。对于肝脏以及其他含银纳米颗粒的特异性靶组织，适当提高加标样品组中银含量的设定值。７．４　标准溶液样品制备７．４．１　内标溶液本标准中选择铟作为内标元素。将铟标准溶液用１％稀硝酸梯度稀释为内标标准工作溶液。若需配制储备液，则储备液于４℃密封保存，６个月内有效。由于不同仪器蠕动泵管内径不同，导致内标与样品溶液混合浓度不同，所以需根据内标元素在样品溶液中的终浓度配制内标工作液。内标元素在样品液中的质量浓度宜为５．０μｇ／Ｌ～５０．０μｇ／Ｌ。７．４．２　系列银标准溶液将银标准溶液用１％稀硝酸溶液梯度稀释为至少五个浓度的系列银标准溶液。若需配制储备液，则储备液４℃密封避光存储，３个月内有效。一般情况下，系列浓度宜为１．００μｇ／Ｌ、２．００μｇ／Ｌ、５．００μｇ／Ｌ、１０．０μｇ／Ｌ、２０．０μｇ／Ｌ、５０．０μｇ／Ｌ，可根据待测样品中实际银含量适当调整系列标准溶液的浓度范围。８　试验步骤８．１　内标的使用分析样品时，将７．４．１中的铟内标工作液由ＩＣＰＭＳ仪的内标管通过蠕动泵持续在线加入，以此来监控仪器信号漂移，并在一定程度上抑制基体效应。内标响应值应介于标准曲线响应值的７０％～１３０％，否则说明仪器发生漂移或有干扰产生，应查找原因后重新分析。注：在线加入内标能够减少大批量样品检测的工作量，但是需避免在三通连接处有气泡时进行待测样品上样，以保证测定元素信号的稳定性。３犌犅／犜３８２６１—２０１９８．２　绘制标准曲线将７．４．２中配制的标准银溶液由低到高浓度依次测量。以标准溶液浓度为横坐标，以银元素信号与内标信号的比值为纵坐标建立标准曲线。至少使用五个浓度的银标准溶液，且相关系数应≥０．９９，否则应重复此步骤。８．３　样品溶液测量分别将７．２．７和７．３中制备的样品依次测量。测定时在线加入与绘制标准曲线时相同量的内标溶液。全程序空白值应低于方法检出限或低于分析批样品最低测定值的１０％。否则应重新分析，排除影响，直至符合要求之后才能分析样品。分析样品中银浓度若超出标准曲线范围，应用１％稀硝酸将样品稀释至标准曲线范围内重新测量。８．４　测量流程图参见附录Ａ中图Ａ．２。９　数据分析按式（１）计算生物样品中银的总质量犿，单位为微克（μｇ）：犿＝ρｄ×犳×犿１犿２×１０００……………………（１）　　式中：ρｄ———分析样品溶液测定质量浓度，单位为微克每升（μｇ／Ｌ）；犳———分析样品溶液的稀释倍数；犿１———分析样品消解液总质量，单位为克（ｇ）；犿２———分析样品１ｍＬ消解液质量，单位为克（ｇ）。按式（２）计算单位质量生物样品中的银含量犡犻，单位为微克每克（μｇ／ｇ）：犡犻＝犿犿Ｔ……………………（２）　　式中：犿Ｔ———生物样品质量，单位为克（ｇ）。１０　准确度和精密度１０．１　准确度同一分析批内，低、中、高空白加标样品批内准确度以回收率犚计，均值一般应在空白加标样品标示值的±２０％之内（低浓度可放宽至±２５％）。银回收率犚按式（３）计算：犚＝犿ｔ犿０×１００％……………………（３）　　式