转基因检测培训教材基因成分检测

食品中转基因成分、真伪鉴别和过敏原及其成分检测质检系统实验室技术能力培训教材主要内容•食品中转基因成分检测•食品中过敏原及其成分检测•食品真伪鉴别（动物源性成分检测）第一部分食品中转基因成分检测一、全球转基因作物种植情况和有关法规介绍全球转基因作物种植面积（1996-2009）2009年不同国家转基因作物种植面积1996年到2009年美国转基因作物的种植百分率巴西、加拿大、中国、印度转基因作物占作物种植面积的比例从08年的80%增长到09年的87%从2008年的86%增加到2009年的93%棉花种植量减少，但仍为68%从2008年的65%增加到2009年的71%9种植国家不断增多9商业化种植：美洲、亚洲、大洋洲、欧洲、非洲25国691213172122232505101520251996199819992000200420052006200820091010大豆,57玉米,25棉花,13油菜,5转基因作物种植比例2009年喷施草甘膦前喷施草甘膦后抗草甘膦油菜RT73非转基因油菜中国培育的转基因抗虫水稻Bt63介绍Bt63母本对照转基因产品标识制度标识类别标识阈值国家/地区强制性标识0中国、印度、菲律宾、印度尼西亚0.9%欧盟、爱尔兰、以色列1%澳大利亚、新西兰、巴西、南非、斯洛文尼亚、克罗地亚、捷克共和国、瑞士、俄罗斯、沙特阿拉伯2%智利、挪威3%韩国、马来西亚5%日本、中国台湾、泰国自愿性标识5%中国香港、美国、加拿大、阿根廷•2001年5月23日，国务院发布了第304号令《农业转基因生物安全管理条例》《农业转基因生物安全管理条例》标识的标注方法转基因动植物（种子、种畜禽、水产苗木）和微生物，直接标注“转基因××”。转基因农产品的直接加工品,标准为“转基因XX加工品（制成品）”或“加工原料为转基因XX”用农业转基因生物或用含有农业转基因生物成份的产品加工制成的产品，但最终销售产品中已不再含有或检测不出转基因成分的产品标注为“本产品为转基因XX加工制成，但本产品中已不再含有转基因成分”或“本产品加工原料中、有转基因XX，但本产品中已经不再含有转基因成分”《农业转基因生物标识管理办法》2002年颁布实施第一批标识管理的转基因生物（5大类17种）大豆种子，豆粒，豆粉，豆油，豆粕玉米种子，玉米粒，玉米粉，玉米油，玉米面油菜种子，油菜籽，菜籽油棉花种子番茄种子，新鲜番茄，番茄酱转基因检测国家标准序号标准号国家标准名称1GB/T19495.1-2004转基因产品检测通用要求和定义2GB/T19495.2-2004转基因产品检测实验室技术要求3GB/T19495.3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法4GB/T19495.4-2004转基因产品检测核酸定性PCR检测方法5GB/T19495.5-2004转基因产品检测核酸定量PCR检测方法6GB/T19495.6-2004转基因产品检测基因芯片检测方法7GB/T19495.7-2004转基因产品检测抽样和制样方法8GB/T19495.8-2004转基因产品检测蛋白质检测方法二、以核酸为基础的检测方法介绍主要内容1.核酸提取纯化方法2.定性检测方法3.定量检测方法4.可能产生误差的原因及消除5.案例分析1.核酸提取纯化方法使用标准方法GB/T19495.3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法A酚-氯仿法提取DNABPVP法提取DNA（Polyvinylpyrrolidone,聚乙烯吡咯烷酮）CCTAB法提取DNA（CetyltrimethyleAmmoniumBromide,十六烷基三乙基溴化铵）D硅土法提取DNAE胍-氯仿法提取DNA•建议使用商业试剂盒核酸提取纯化方法核酸提取纯化方法•酚-氯仿法提取DNA、胍-氯仿法提取DNA利用酚和胍使蛋白质变性，释放出核酸,同时抑制了DNase的降解作用，保护核酸。利用氯仿加速有机相与液相分层。•PVP法提取DNA、CTAB法提取DNA利用高浓度去垢剂在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，得到水相中的核酸。•硅土法提取DNA利用硅土对核酸的吸附作用，分离核酸。转基因产品的检测策略StrategyforGMODetection转基因transformationPlantgenomePlantgenome品系特异性检测EventSpecificDetection结构特异性检测ConstructSpecificDetection植物基因组Recipientgenome重组产生GMORecombinantPlant作物种属检测Taxondetection增强子Enhancer筛选检测Screendetection基因Gene终止子Terminator启动子Promoter筛选检测ScreendetectionGB/T19495.4-2004转基因产品检测核酸定性PCR检测方法使用标准方法主要内容本标准方法规定了转基因产品检测的核酸定性PCR方法，适用于种子、饲料、食品和环境样品中转基因成分的定性检测。从以下五个方面进行介绍：A.方法简介B.检测目标物C.检测体系D.结果判定E.结果表述A.方法简介•普通PCR+电泳方法原理聚合酶链式反应（PCR）在反应缓冲液中，脱氧核糖核酸、寡核苷酸引物在DNA聚合酶的作用下经循环反应对目标序列进行复制。PCR产物可用琼脂糖凝胶电泳方法依据DNA分子长度的不同加以分离。A.方法简介•缺点：1.普通PCR灵敏度可达到0.1％，而实时荧光PCR检测下限可达到0.01％。2.电泳存在EB等致癌物质，需要特殊处理。3.检测时间长。B.检测目标物1物种特异性检测方法大豆、番茄、玉米、油菜、马铃薯、棉属作物、真核生物18SrRNA、叶绿体多拷贝DNA序列检测方法。2筛选检测方法：CaMV35S启动子、NOS终止子、NPTII基因、FMV35S启动子筛选检测方法。3结构基因特异性检测方法抗草甘膦大豆、转基因番茄Zeneca®、转基因玉米Bt11、Bt176、T25、转基因马铃薯NewLeaf®Plus、NewLeaf®Y结构基因特异性检测方法。4品系特异性检测方法转基因玉米MON810、抗草甘膦油菜RT73品系特异性检测方法、棉花MON531、华番一号。C.检测体系表2定性PCR测试的反应体系试剂名称Regent50µl反应体系Totalvolumeof50ul(µl)25µl反应体系Totalvolumeof25ul(µl)10×Buffer5.02.510×dNTP5.02.510×Mg2+5.02.5Taq酶TaqEnzyme0.30.2正义引物(5uM)1.00.5反义引物(5uM)1.00.5H2O30.715.3模板Template2.01.0(约30ngDNA)D.结果判定PCR检测时应做平行对照，两份平行样品结果应保持一致。如果一个样品结果为阳性而另一个为阴性时，应重新进行检测。可以通过增加PCR反应中DNA的模板量使两份平行样结果一致。所检测目标片段出现扩增，且PCR产物经过确认，所有对照结果正常，结果判定为阳性，所检测目标片段未出现扩增;所有对照结果正常，结果判定为阴性。一般要求•实验结果不能用“+/－”来表述。•阴性结果不能用“不含GMO”（“GMOnotpresent”）来表述。E.结果表述阴性结果的表述测试报告应该包括下列内容：•“对于X物种，未检测出转基因成分。•根据xxx（即标准参照物质），该方法的检测下限为X%。”•英文表述为：•“ForspeciesX,GMOderivedmaterialwasnotdetected.•TheLODofthemethodisX%determinedwithxxx(identifythereferencematerial).”•测试报告应该包括下列内容：•“对于X物种，检测出转基因成分。”•英文表述为：•“ForspeciesX,thepresenceofGMOderivedmaterialwasdetected.”阳性结果的表述3.核酸定量PCR检测方法使用标准方法GB/T19495.5-2004转基因产品检测核酸定量PCR检测方法本标准方法规定了转基因成分核酸定量检测方法，适用于种子、饲料、食品和环境样品中转基因成分的实时荧光PCR定量检测。从以下五个方面进行介绍：主要内容A.方法原理简介B.检测目标物C.检测体系D.定量计算E.结果表述•实时荧光PCR方法：在普通PCR基础上引入标记有荧光基团的寡核苷酸探针，可与目的片段结合，在DNA聚合酶的作用下寡核苷酸降解，荧光释放出来。荧光的积累与PCR产物的形成同步，荧光的强度反映了产物生成的量。•通过设置标准物质/分子，绘制出标准曲线，进而可对样品中的目标分子进行定量判断。•优点：1.快速2.灵敏3.污染小A.方法原理简介实时荧光PCR的原理R=ReporterFAM™orVIC™DyesQ=QuencherTAMRA™DyeRQ扩增曲线：域值和Ct值SampleNoTemplateThresholdBaselineRn+Rn-CtEVENT176玉米中CryIA(b)标准曲线B.检测目标物1.转基因大豆GTS-40-3-2；2.转基因玉米MON810、Bt176、Bt11及GA21；3.转基因油菜RT73。试剂名称终浓度10×PCR反应缓冲液1×MgCl22.5mmol/LdNTPs(含dUTP)0.2mmol/LUNG酶***0.075U引物(上游)0.2mol/L引物(下游)0.2mol/L探针0.1mol/LTaq酶***2.5UDNA模板(20ng~30ng/L)5L补水至50L*DNA模板可视加工程度适当增加模板量。C.检测体系转基因产品含量（%）＝测试样品中外源基因的拷贝数×100%测试样品中内源基因的拷贝数D.定量计算E.结果表述定量检测结果有4种情况，每种检测结果表述如表检测结果结果表述未检出物种内源特异性基因该样品未检出XX物种内源特异DNA成分检出物种内源特异性基因，但未检出目标外源基因片段该样品未检出转基因成分，定量方法检测限为X%检出物种内源特异性基因和目标外源基因片段，但含量小于定量方法检测限该样品中XX转基因成分低于本定量方法检测限（X%）检出物种内源特异性基因，目标外源基因含量在标准曲线范围内（1）在组分A中，XX转基因成分为X%；（2）若在多个组分中检出转基因成分，应分别报告每个组分的转基因成分含量：“组分A的XX转基因成分为X%，组分B的XX转基因成分为Y%”4.可能产生误差的原因及消除试验结果可能受到提取样品DNA、反应体系及条件及试验环境等方面的影响，为保证试验结果的准确性从以下三个方面进行论述：（1）核酸提取的质量控制（2）定性PCR检测的质量控制（3）定量PCR检测的质量控制（1）核酸提取的质量控制对照的设置：每个检测样品设置两个提取平行样。·提取空白对照：以水代替样品，避免化学试剂污染而影响。·提取阴性对照·提取阳性对照DNA检测：•可以通过琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的质量；•用核酸蛋白测定仪来测定DNA浓度，但这不是必须的。•要检测内源基因来判断所提取的DNA是否适合PCR扩增。（2）定性PCR检测的质量控制PCR检测反应要设置平行实验，两份平行的测试结果应保持一致，否则要重新进行检测。PCR检测反应要设置试剂空白对照、阳性目标DNA对照、阴性目标DNA对照、提取空白对照。检测反应完成后，若所有对照结果正常，所检测目标DNA出现扩增，结果判断为阳性，所检测目标DNA未出现扩增，结果判断为阴性。（3）定量PCR检测的质量控制标准曲线的质量影响度量的不确定性。标准曲线上每个浓度应做3个平行。每批测试实验需要设置对照如：空白对照、阳性对照、阴性对照，以及PCR抑制物对照，所有对照的结果中若有一项不符合者，测试结果应放弃重做实验。每个重复的测试样品测试结果（转基因成分含量）的相对相差大于或等于35%，测试结果应放弃，并应从制备测试样品开始重做试验。应用PassiveRe