Ghrelin对MPP诱导的MES235细胞凋亡的保护作用及

青岛大学硕士学位论文Ghrelin对MPP'+诱导的MES23.5细胞凋亡的保护作用及可能机制的探讨姓名：董娟娟申请学位级别：硕士专业：生理学指导教师：姜宏;谢俊霞20090612Ghrelin对MPP'+诱导的MES23.5细胞凋亡的保护作用及可能机制的探讨作者：董娟娟学位授予单位：青岛大学相似文献(10条)1.期刊论文曹非.孙圣刚.童萼塘.骆芳帕金森病大鼠黑质细胞凋亡与Bax蛋白表达相关性的实验研究-中国康复2007,22(5)目的:观察6-羟基多巴胺(6-OHDA)能否诱发黑质细胞凋亡以及Bax蛋白表达与黑质细胞凋亡的关系.方法:72只Wistar雄性大鼠随机分为对照组36只及通过脑立体定位注射6-0HDA的方法建立的大鼠帕金森病模型组(PD)组36只,采用TUNEL方法、免疫组织化学、电镜等观察术后l、7、l4及2ld时2组大鼠脑黑质细胞凋亡的数量及超微结构变化,并检测黑质细胞Bax蛋白的表达.结果:术后TUNEL法发现,与对照组比较,PD组存在明显的黑质细胞凋亡(P＜0.05),且在1-21d时细胞凋亡数逐渐增高;电镜观察显示,PD组黑质细胞存在典型细胞凋亡,Bax蛋白表达在ld为最高,其后很快下降,但仍显著高于对照组.结论:6-羟基多巴胺能诱发大鼠黑质细胞凋亡,Bax蛋白是黑质细胞凋亡的关键启动因素.2.期刊论文王顺.蒋花.曲龙.WANGShun.JIANGHua.QuLong头部电针透穴对帕金森病模型大鼠细胞凋亡的作用机制研究-中国针灸2009,29(4)目的:探讨头部电针透穴治疗帕金森病(PD)的作用机制.方法:将40只Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、针刺组,以6-羟基多巴胺(6-OHDA)左侧纹状体注射法制备偏侧PD大鼠模型,针刺组穴取百会透太阳,每日1次,6日为一疗程.其他3组不予治疗,观察2个疗程.采用免疫组织化学方法观察各组左侧黑质神经营养因子(BDNF)面密度(阳性目标总面积与统计场总面积比值)、积分光密度,用高效液相色谱观察左侧纹状体多巴胺(DA)含量,以TUNEL法观察各组细胞凋亡数.结果:针刺组与模型组比较,左侧黑质BDNF面密度、积分光密度均显著增大(P0.05);细胞凋亡数量为(23.80±3.83)个,显著减少(P0.05);纹状体DA含量显著增多(P0.05).结论:头部电针透穴可能是通过增强黑质BDNF蛋白表达水平来减少细胞凋亡数量.3.期刊论文曹非.孙圣刚.童萼塘.骆芳帕金森病大鼠黑质细胞凋亡与Bax蛋白表达相关性的实验研究-中国老年学杂志2003,23(6)目的观察6-羟基多巴胺(6-OHDA)能否诱发黑质细胞凋亡以及Bax蛋白表达与黑质细胞凋亡的关系.方法通过脑立体定位注射6-OHDA的方法建立大鼠帕金森病(Parkinsondisease,PD)模型,采用TUNEL方法、免疫组织化学、电镜观察等方法,选择6-羟基多巴胺注射术后1d、7d、14d、21d为研究时点,观察大鼠PD模型形成过程中黑质细胞凋亡的数量及超微结构变化情况,并检测黑质细胞Bax蛋白表达情况变化.结果用TUNEL法发现黑质细胞存在细胞凋亡,与对照组存在显著性差异,1d～21d细胞凋亡数逐渐增高;电镜观察在此过程中黑质细胞存在典型的细胞凋亡,Bax蛋白表达在1d为最高,其后很快下降,但显著高于对照组.结论6-OHDA能诱发大鼠黑质细胞凋亡,Bax蛋白是黑质细胞凋亡的关键启动因素.4.学位论文徐杰利福平抑制α-突触共核蛋白聚集作用的实验研究2006一.研究背景帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是一种常见于中老年人的中枢神经系统变性疾病，主要病理改变为黑质—纹状体多巴胺能神经元进行性变性、死亡，同时伴随残存神经元内出现嗜酸性包涵体(路易小体，Lewy小体)，纹状体多巴胺含量降低。α-突触共核蛋白(α-synuclein)聚集形成的不溶性纤维积聚物，是构成路易小体(帕金森病主要病理特征)主要成份；并且随着对帕金森病的深入研究，在其病因及发病机制方面已取得了很大的进展。越来越多的证据显示，可溶性α-synuclein向异常纤维状的α-synuclein转化是帕金森病发病机制的关键环节，是帕金森病各种诱发因素的共同通路。研究表明，在基因突变及环境因素协同作用下，多巴胺能细胞内α-synuclein发生错误折叠和聚集，导致细胞内多巴胺浓度提高，进而引起氧化应激反应。α-synuclein的聚集亦能影响泛素-蛋白酶体系统对其降解，进一步造成大量的α-synuclein的聚集并形成细胞内包涵体，影响细胞正常功能及代谢，从而引起细胞死亡，导致帕金森病。目前帕金森病新的治疗方法有外科手术、脑深部电极高频刺激、基因治疗、神经干细胞移植等，但疗效均未有很大突破，大多数病人仍需药物治疗。外源性左旋多巴是最有效的抗帕金森病药物，但只能控制症状而无法阻止疾病的进展，并且长期使用左旋多巴会引起一些症状波动、运动障碍和精神异常等并发症，其中尤其是开—关现象、异动症等并发症使患者及其家属产生畏惧感。因此，寻找一种能够阻止疾病进展的药物，将为帕金森病的治疗带来新的希望。利福平(rifampicin，RFP)是半合成利福霉素的衍生物，为广谱抗生素，是诺卡氏菌的发酵产物，在临床应用已久，为抗结核的主要药物之一。另可用于麻风病治疗，并且随着药理学和药效学研究的深入开展，利福平的应用己越来越广泛。流行病学研究显示，服用抗麻风病药物利福平或氨苯砜几年的麻风病人，其老年性痴呆的患病率明显减低，推测抗麻风药物可能有抑制β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)聚集的作用。并有大量研究表明利福平有抑制β淀粉样蛋白聚集的作用，但具体的机制仍不清楚，推测利福平可能作为一种自由基清除剂起作用。由α-synuclein及其碎片聚集形成的病理性包涵体除存在于帕金森病外，还存在于老年性痴呆患者的老年斑中，而且α-synuclein与β-淀粉样蛋白共同的结构特点以及它们之间的相互作用，提示了帕金森病和老年性痴呆病理过程的相似性。另据美国加州大学生化部的生化物理实验研究结果显示，抗生素利福平以浓度依赖的形式抑制α-synuclein纤维形成，使其现有的纤维解聚。该研究的结果是令人兴奋的，因为阻止了α-synuclein的聚集，就有可能阻止帕金森病的进展，而使已经聚集的α-synuclein纤维解聚，甚至有可能使疾病逆转。但目前国内外尚未见到利用细胞和动物模型来验证这一结论。我们利用1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导PC12细胞大量表达α-synuclein，并产生聚集，观察利福平抑制α-synuclein聚集的作用，为进一步动物实验及其应用于帕金森病的临床治疗提供初步实验依据。二.研究目的1.构建大量表达α-synuclein并产生聚集的帕金森病细胞模型。2.明确利福平对帕金森病细胞模型有保护作用。3.探讨利福平具有抑制α-synuclein聚集的作用。4.为进一步动物实验及应用于帕金森病的临床治疗提供依据。三.实验对象和方法1.细胞株PC12：大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞株。2.细胞培养及药物处理PC12细胞置于DMEM/F12培养基中进行培养，每隔48h换培养液，当单层培养细胞汇合以后，传代培养。将PC12细胞传入96或6孔培养板中，待细胞进入对数生长期后加药，加入不同剂量的利福平，利福平溶解于甲醇中，使终浓度分别达到0、100、200、300μmol/L，2h后分别加入MPP+，终浓度为1mmol/L，以上剂量用于所有实验。实验分为6个组：(1)正常对照组；(2)0μmol/L利福平&MPP+(MPP+组)；(3)100μmol/L利福平&MPP+；(4)200μmol/L利福平&MPP+；(5)300μmol/L利福平&MPP+；(6)等体积甲醇&MPP+组六组。3.研究方法(1)四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测干预48h后每孔加入20μlMTT，37℃、5％CO2培养箱内培养4h，弃液，每孔加入150μlDMSO，振荡仪振荡10min，至晶体颗粒溶解，在酶标仪上测定595nm的吸光度。(2)WesternBlot免疫印记检测α-synuclein的表达干预48h后，细胞裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白；BCA-100蛋白质定量测定试剂盒测定样品总蛋白含量；每泳道加总蛋白20μg进行SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至硝酸纤维素膜上，封闭液封闭3h，一抗孵育4℃孵育过夜，与辣根过氧化物酶标记二抗室温下孵育1h，X线胶片曝光1～10min，显影、定影，图像分析处理。(3)流式细胞仪检测细胞凋亡PC12细胞接种于6孔培养板中，培养48h后干预处理，继续培养48h后PBS漂洗，加入AnnexinV-FITC和PI染液重悬细胞，室温避光温育10分钟，HEPES洗涤后过滤上机检测，分析结果。4.统计学处理结果以均数±标准差表示。两组间均数比较采用两独立样本的t检验，多组间比较采用单因素方差分析。数据采用SPSS10.0统计软件包分析，P＜0.05表示有统计学差异。四.实验结果1.MTT检测细胞活性显示MTT比色法检测各组细胞活性结果显示，MPP+处理组细胞存活率为76.6％±6.4％，甲醇&MPP+组细胞存活率为71.2％±9.9％，较对照组细胞活性明显下降，而利福平(100、200、300μmol/L)&MPP+处理组细胞存活率分别为91.9％±7.9％、99.8％±8.0％、100.1％±9.1％，利福平&MPP+各组较MPP+处理组细胞活性明显增加，并呈量效依赖关系。统计学分析MPP+处理组与空白对照组比较，P＜0.01有统计学差异；利福平&MPP+各组与MPP+处理组比较，P＜0.05，有统计学差异，甲醇&MPP+组与MPP+组无差异。2.Westernblot免疫印记检测α-synuclein显示免疫印记结果显示，MPP+促进α-synuclein的表达并聚集形成三聚体，随着利福平的药物浓度增大，α-synuclein三聚体蛋白的表达减少，而甲醇&MPP+组与MPP+组无差异。3.流式细胞仪检测凋亡结果显示流式细胞凋亡检测结果，空白对照组、MPP+处理组、甲醇&MPP+组及利福平(100、200、300μmol/L)&MPP+各浓度组的细胞凋亡率分别为10.63％±0.98％、67.35％±1.72％、74.74％±1.85％、63.45％±1.24％、27.01％±2.74、％22.35％±2.9％；结果显示MPP+组及甲醇&MPP+组的细胞凋亡率明显高于空白对照组，而利福平&MPP+各组随着利福平的浓度增加，细胞凋亡率明显下降，利福平&MPP+各浓度组与MPP+组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。五.结论1.MPP+对细胞具有毒性作用，引起细胞凋亡，并诱导PC12大量表达α-synuclein并聚集。2.利福平可以阻断MPP+诱导的PC12细胞凋亡。3.利福平能够抑制α-synuclein的表达及聚集。5.期刊论文孙红梅.白丽敏.张军.吴海霞.许红.崔龙.SUNHong-mei.BAILi-min.ZHANGJun.WUHai-xia.XUHong.CUILong银杏平颤方对帕金森病鼠多巴胺神经元丢失和细胞凋亡的影响-北京中医药大学学报2006,29(2)目的探讨银杏平颤方防治帕金森病的机制.方法采用腹腔注射MPTP建立小鼠帕金森病模型.分别应用免疫组化方法和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法观察中药对中脑黑质多巴胺神经元丢失和细胞凋亡的影响.结果模型组小鼠中脑黑质致密部酪氨酸羟化酶阳性神经元的数目比正常组明显减少,28天比14天减少更明显;银杏平颤方及其拆方各中药治疗组可部分减少黑质致密部TH阳性神经元的丢失;模型组小鼠中脑黑质致密部凋亡细胞的数量明显增多,14天比28天增加更明显,中药各治疗组可不同程度地抑制该部位细胞的凋亡.结论细胞凋亡可能是帕金森病小鼠中脑多巴胺神经元丢失的主要方式之一,银杏平颤方可通过抑制细胞凋亡减少多巴胺神经元的丢失,达到防治帕金森病的作用.6.学位论