科技奖励申报(禽流感动物模型、免疫机理及疫苗研制

2019/9/18肇庆大华农生物药品有限公司广东省实验动物监测所广东大华农动物保健品股份有限公司2011年11月禽流感动物模型、免疫机理及疫苗研制与推广应用2019/9/18立项背景总体思路主要技术内容主要创新点汇报提纲五六三二一四七相关知识产权与获奖励情况主要技术经济指标与推广效益主要完成人对项目的贡献2019/9/18禽流感的危害经济损失巨大危害人类健康影响国家形象和社会稳定一立项背景（1）迄今为止，全世界已有超过4亿只家禽染病死亡或惨遭扑杀，造成的经济损失高达200亿美元我国2004年、05年、06年大规模爆发禽流感，养禽业损失150亿美元以上世界卫生组织（ＷＨＯ）发出警告，一场全球性的流感大流行将会导致200万－700万人命丧黄泉人们心理恐慌，不敢吃鸡，家禽业受损，出口受阻，旅游业受挫，行业经济全面受到冲击，影响社会稳定粮农组织的资料显示，H5N1高致病性禽流感疫情于2003年爆发后，在全球己感染565人，导致331人死亡。今年9月，联合国粮食及农业组织(FAO)官员卢布罗夫日前发出警告，一种致命的“H5N1”高致病性禽流感变种病毒在越南出现。现有的所有疫苗对该病毒均无效果。2019/9/181、我国地域辽阔，候鸟的迁簁致使禽流感长期存在，加剧防疫的难度。2、禽流感毒株变异快，对疫苗防控技术提出新的挑战。3、动物禽流感疫苗生产工艺落后，标准化水平低，亟待改进。4、研究人禽流感疫苗和药物缺乏哺乳动物模型，有待摸清和建立哺乳动物的免疫机理。针对以上问题，进行了“禽流感动物模型、免疫机理及疫苗的研究”肌肉变绿一立项背景（2）禽流感防治存在的问题2019/9/18二总体思路1、通过蛋白重组技术，建立禽流感疫苗产业化的基础种毒和疫苗毒株，研制高致病性多变异型的高效疫苗，用于动物禽流感的防控。2、利用造模毒株建立哺乳动物模型,为人禽流感疫苗和药物研究提供技术支持。3、研究新的生产工艺，制定新的标准，为禽流感疫苗产业化提供检验标准和制造标准。2019/9/18三主要技术内容禽流感动物模型、免疫机理及疫苗研究1、禽流感毒株制备5、新工艺、新标准4、禽流感系列疫苗3、禽流感免疫机理2、哺乳动物模型及模型指标2019/9/18三主要技术内容（1）1、制备禽流感毒株筛选造模毒株确定鹅源禽流感H5N1病毒(A/Goose/Guangdong/NH/2003)是适宜的毒株，不必经哺乳动物细胞适应，利用鸡胚内扩增病毒后即可感染哺乳类实验动物，并在体内增殖，表现出与人禽流感相似的临床病症。筛选疫苗毒株最终选取H5N1（Re-1/4/5）、H9（SS）和(SS/94)作为制备疫苗毒株，这些毒株毒力弱、免疫原性好，能突破母源抗体干扰，生产种毒各项性能指标领先。2019/9/18三主要技术内容（2）2、研究建立哺乳动物模型及模型指标（1）利用造模毒株建立了近交系BALB/c小鼠和封闭群ICR小鼠两个小鼠模型。确定了近交系BALB/c小鼠和封闭群ICR小鼠的接种剂量100uL，可使感染小鼠死亡率达到73%；通过不同接种途径的研究，确定鼻腔接种后感染小鼠出现明显的禽流感临床疾病过程。同时确定了小鼠模型的临床症状、死亡率、病理变化、病毒复制、免疫反应等方面指标要符合人类感染禽流感疾病的基本特征（2）确定用“环甲膜穿刺术”经气管接种为猴呼吸道接种方式，建立了恒河猴模型。该方法可以将接种物直接接种到肺内，操作技术简单，定量准确，动物损伤较小，不需较高防护设备。同时确定了恒河猴模型的临床症状、体温、呼吸频率、感染器官、抗体水平、外周血白细胞的动态变化、外周血T淋巴细胞及其亚群的动态变化、免疫因子、病理变化方面的指标，要与人禽流感疾病相似。2019/9/18三主要技术内容（3）3、研究禽流感免疫机理小鼠模型免疫机理（1）主要表现T细胞免疫功能损伤，这种损伤与感染病程的发展和转归相一致，细胞免疫功能指标下降时期也是病情严重时期。到达恢复期各指标渐恢复正常。T细胞免疫功能低下是免疫病理改变之一。（2）细胞因子表达失去平衡或过多的表达，都可能对宿主产生免疫病理损伤，推测这是H5N1禽流感引起哺乳动物严重疾病的另一重要致病机制。恒河猴模型免疫机理主要表现为外周血淋巴细胞数和一些T淋巴细胞亚群在第1天出现一过性下降，T淋巴细胞亚群CD3＋T淋巴细胞、CD3＋CD4+T淋巴细胞和CD3＋CD8+T淋巴细胞也在感染的第1天出现一过性的下降，感染后第7天出现抗体，并逐渐升高，11天后达到最高，至90天仍维持较高水平。抗H5N1抗体能有效保护并减轻病毒对机体的再次攻击，抑制病毒增殖，为人禽流感疾病的免疫接种或抗体治疗提供了直接依据。2019/9/18三主要技术内容（4）4、研制禽流感系列疫苗①建立生产种子库研究质量控制关键点将基础毒种经SPF鸡胚复壮、增殖与传代，建立种子批，经病毒含量、血凝特性、毒力、安全性、免疫原性、特异性、纯粹检验等试验检验均符合要求。同时，定期对不同代次的基础种毒和生产用种毒对免疫原性相关基因HA和NA进行测序并分析其序列是否变异，以确保种毒不发生变异。（1）确定多联疫苗的质量控制关键点为“抗原浓缩”和“乳化”技术；（2）通过比较Millipore的横向切流、中空纤维、连续离心等进行浓缩抗原的方法，最终确定了抗原浓缩（2~3倍）是免疫保护效果与单苗一致的关键工艺。（3）研究不同乳化设备对乳化效果的影响，最终确定选择了进口乳化设备是最佳乳化工艺的关键。按照该工艺生产的疫苗，乳化颗粒均匀，稳定性好，疫苗中抗原释放速度合理。该种疫苗在2-8℃的保存期超过15个月，疫苗免疫鸡后持续期超过5个月。2019/9/18三主要技术内容（5）在实验室研制、中试研制取得成功的基础上，向农业部申报新兽药证书和生产批准文号，本项目成功研制并获得2个新兽药证书和5个生产批文：H5+H9(N28+SS)、ND+IB+H9（LaSota+M41+SS/94)、H5N1（Re-1)、H5N1（Re-5)、H5N1（Re-5+Re-4)、H9（SS)中试生产及临床应用申报新兽药证书和生产批文在实验室试制取得成功的基础上，在生产车间按照制定的《制造及检验试行规程》连续生产不少于3批，经检验合格后，申报获得临床批文，对不同品种普通鸡免疫，免疫数量不少于20000只，通过观察免疫后的临床症状和检测抗体水平，确定试制产品安全有效，同时最终确定免疫剂量、保存条件和保存期，建立质量标准。4、研制禽流感系列疫苗②2019/9/18三主要技术内容（6）5、研究新工艺、新标准（1）采用多级筛选、保证抗原质量：胚蛋、孵化前期、后期、接种后和收获前均对不合格的胚蛋进行挑除；（2）筛选优化疫苗配方，解决了免疫后出现疫苗残留、肿块、肌肉变绿等不良反应；（3）对疫苗乳化颗粒大小进行了监控，疫苗乳化颗粒大小为0.2-3微米；极大地延长了疫苗保存期（2年），远高于国家标准（1年）。提出了原材料的来源和质量要求改进生产工艺（1）经过研究最终确定采用SPF或非免胚蛋培养病毒，能极大地提高病毒滴度并降低了外源病毒的污染；（2）研究、筛选国内外油佐剂，最终确定采用进口佐剂，相对传统生产工艺疫苗免疫后，HI抗体水平提高1-2滴度。2019/9/18四主要创新点1•在国内外首次研究哺乳动物感染禽流感的免疫机理,率先建立了禽流感感染模型及指标。2•发现黄酮类化合物及单抗物质能有效防治禽流感。3•研制了防控禽流感新型系列疫苗。4•建立了禽流感疫苗新工艺、新标准，完善行业标准。2019/9/18四主要创新点（1）1、在国内首次研究哺乳动物禽流感免疫机理，率先建立禽流感感染模型及模型指标。项目查新结论除本项目的相关研究人员发表的论文外，未见到国内和国外有与本委托项目“禽流感H5N1病毒初次和再次感染中免疫机理的实验研究”中较早且系统测定禽流感H5Nl病毒的哺乳动物BABL/C小鼠模型的CD3+T、CD4+T、CD8+T细胞免疫和IL-2、IL-4、IL-10、IL-18、TNF-α与IFN-γ细胞因子变化的创新点相同的文献报道，创新点相同的文献、专利和成果报道。2019/9/18四主要创新点（2）2、发现黄酮类化合物及单抗物质有效防治禽流感。项目查新结论除本项目的相关研究人员发表的论文外，未见到国内有与本委托项目中直接利用鹅源禽流感H5N1病毒感染哺乳动物、在未经预先适应的情况下通过鼻腔接种ICR小鼠和BALB/c小鼠或通过“环甲膜穿刺术”经气管注射感染恒河猴的造模方法、小鼠模型及恒河猴模型、模型指标等创新点相同的文献、专利和成果报道。植物黄酮类化合物的用途表没食子儿茶素没食子酸酯微囊颗粒及其制备工艺2019/9/18四主要创新点（3）3、研制了防控禽流感的系列疫苗禽流感（H5+H9）二价灭活疫苗（N28+SS株）鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）三联活疫苗（LaSota株+M41株+SS/94株）2019/9/18四主要创新点（4）4、研究新工艺，制定新标准，改善行业标准。指标原标准新标准新标准效果鸡胚无标准SPF或非免胚蛋毒价高、无外源病毒油佐剂无标准4项芳烃指数、粘度、灭活技术不适应灭活剂浓度、温度提高抗原免疫原性浓缩技术无标准EID50≥1.0,HA≥2免疫后，抗体水平提高2-3Log2,保护期≥6个月粘度≥8秒/ml≥6秒/ml提前7天抗体有效保护，无副反应2019/9/18五主要技术经济指标与推广效益（1）主要技术指标疫苗指标名称新标准原行业标准原材料列入目录，有技术指标无抗原滴度HA〉9.0；EID50〉8.0HA〉8.0；EID50〉7.0疫苗颗粒度0.2-3微米无内毒素提出质量标准，完善2005版疫苗规程黏度〈6秒〈8秒保存期〉2年〉1年攻毒保护全部健活不小于4/5免疫后抗体水平HI不小于9HI不小于6小鼠和恒河猴模型感染禽流感病毒后，其病理症状应符合人类感染禽流感疾病的基本特征，成功建立了禽流感的动物模型。建立了抗原浓缩技术、填补了动物疫苗细菌内毒素检测技术、突破了乳剂疫苗的颗粒度，解决了乳剂疫苗的不稳定性和分层，疫苗保护期延长至2年，完善了疫苗生产新标准。附：疫苗质量新标准2019/9/18主要经济指标①2008-2010年项目经济效益年份新增利润新增税收创收外汇节支总额20083461.892281.3337.8018672.3220094646.852238.4095.8220400.3120106863.732714.29128.8117749.33累计14972.477234.03262.4356821.96（单位：万元/万美元）五主要技术经济指标与推广效益（2）2019/9/182003-2010年共销售禽流感疫苗156.24亿羽份，年均增长率34%；实现销售收入11.44亿元，年均增长28%。五主要技术经济指标与推广效益（3）主要经济指标①2003-2010年禽流感疫苗销售量（亿羽份）2003-2010年禽流感疫苗销售收入（万元）2019/9/1808-10年H5亚型禽流感疫苗推广应用情况（万羽份）五主要技术经济指标与推广效益（4）2019/9/18越南注册证埃及注册证08-10年禽流感疫苗出口产品情况（万羽份）五主要技术经济指标与推广效益（5）2019/9/18•禽流感疫苗是防控疫情的关键，为养禽业的生产安全保驾护航。控制疫情发生，降低动物对人感染的风险。•近3年销售禽流感疫苗47.33亿毫升，减少禽类捕杀损失1154亿元，节省治疗费用5亿元H5：69.95亿羽份×3斤/只×5.5元/斤=1154.18亿元H9：24.7亿羽份×（0.3-0.07）元/只=5.68亿元•保证养禽业健康发展，增加农民收入，推进“三农”工作实施。社会效益五主要技术经济指标与推广效益（6）2019/9/18六相关知识产权与获奖励情况（1）获得发明专利2个：---植物黄酮类化合物的用途（授权号：ZL200410074592.8）；---表没食子儿茶素没食子酸酯微囊颗粒及其制备工艺（授权号：ZL200710165270.8）获得新药证书2个：---禽流感(H5+H9)二价灭