2020石斛功能性食品开发研究

石斛功能性食品开发研究石斛功能性食品开发研究一、石斛碱（≥98%）的制备二、金钗石斛功能食品研制三、资金使用情况四、论文、专利一、石斛碱（≥98%）的制备•（1）材料与方法•（2）结果与分析•（3）结论•（4）石斛碱生产工艺流程一、石斛碱（≥98%）的制备（1）材料与方法1.1材料与设备试验材料：金钗石斛产自贵州赤水市，干燥后取茎段粉碎，过80目筛备用。主要试剂：纤维素酶(酶活力≥10000U/g)，石斛碱对照品（纯度≥99%），乙醇、HCl、氨水、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醚均为分析纯，硅胶（200目，色谱纯）。主要设备：万能粉碎机FW-400A、回流提取装置、EYELA旋转蒸发仪、HH-S恒温水浴锅、PHS-2C数字酸度计，赛多利斯电子天平、气相色谱仪、质谱仪。一、石斛碱（≥98%）的制备1.2研究方法1.2.1石斛碱含量测定方法：色谱柱：OV1701，检测器FID；分别精密吸取0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、2.5μL的石斛碱对照品溶液进样，以峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制石斛碱的标准曲线。1.2.2石斛碱的提取：称取10.0g石斛粉于250mL圆底烧瓶中，加入30mL含己活化纤维素酶的缓冲液，并轻轻搅拌，恒温酶解一定时间后立即升温至90℃灭酶，加入90mL无水乙醇回流提取石斛碱3h，过滤提取液、旋转蒸干、预处理后测定石斛碱含量，计算提取率。一、石斛碱（≥98%）的制备1.2.3酶解pH对石斛碱收率的影响：在其它条件不变的情况下，在pH分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0的缓冲液中对石斛粉进行纤维素酶解处理，乙醇提取后按GC方法测定石斛碱含量，计算提取率。1.2.4酶解温度对石斛碱收率的影响：在其它条件不变的情况下，于20℃、30℃、40℃、50℃和60℃进行纤维素酶解处理，乙醇提取后按GC方法测定石斛碱含量，计算提取率。一、石斛碱（≥98%）的制备1.2方法1.2.5酶解时间对石斛碱收率的影响：在其它条件不变的情况下，酶解时间分别设定为0h，lh，1.5h，2h和2.5h，乙醇提取后按GC方法测定石斛碱含量，计算提取率。1.2.6酶用量对石斛碱收率的影响：在其它条件不变的情况下，分别加入0mg/g(石斛粉)、1mg/g、3mg/g、5mg/g、7mg/g、9mg/g和11mg/g的纤维素酶进行酶解，乙醇提取后按GC方法测定石斛碱含量，计算提取率。一、石斛碱（≥98%）的制备1.2.7石斛碱的薄层板检测（TLC）：采用硅胶薄层板对石斛碱进行分析，展开系统为：氯仿-乙酸乙酯（4:1），显色剂为碘化铋钾溶液储存液：石斛碱的相对比移值（Rf）约0.411.2.8不同乙醇浓度对石斛碱提取率的影响：将“1.2.2”项下30mL酶解液真空干燥，分别加入120mL（固液比1:12）55%、65%、75%、85%和95%的乙醇回流提取3小时，过滤、浓缩、干燥后测定石斛碱含量，计算提取率。一、石斛碱（≥98%）的制备1.2.9不同固液比(乙醇用量)对提取率的影响:将“1.2.2”项下30mL酶解液真空干燥，分别加入80mL（固液比1:8）、100mL（1:10）、120mL（1:12）、140mL（1:14）和160mL（1:16）75%的乙醇回流提取3小时，过滤、浓缩、干燥后测定石斛碱含量，计算提取率。1.2.10碱液pH值对有机溶剂反萃取石斛碱的影响:乙醇浸膏6份，分别加入2倍体积2%的HCl溶液进行搅拌（捏溶）提取，沥出提取液，再次加入2被体积2%的HCl溶液进行提取，沥出提取液；向上述酸水层中加入氨水分别调节pH至5、6、7、8、9和10，用等体积二氯甲烷进行萃取，则石斛碱进入二氯甲烷层，而其它水溶性杂质留于水相，收集二氯甲烷提取液，浓缩干燥后测定石斛碱含量，计算回收率。一、石斛碱（≥98%）的制备1.2.11硅胶柱层析纯化法上柱：+收集：+计算回收率。1.2.12重结晶纯化法将1g石斛碱粗品（84.0%）置于烧杯中，分别溶解于不同的有机溶剂中在-20℃下尝试结晶，获得的结晶产物冷冻干燥后用GC法测定其石斛碱含量。一、石斛碱（≥98%）的制备1.2.13气质联用法（GC-MS）确认石斛碱身份：气相色谱条件：色谱柱为PhenylMethylSiloxane30m×0.25mm×0.25μm弹性石英毛细管柱；采用程序升温，50℃保持1min，以6℃/min上升至100℃，然后以3℃/min上升至180℃，再以20℃/min上升至260℃，恒温5min；汽化室温度250℃；载气为高纯He（99.999%）；柱前压51.98kPa；载气流量1.0mL/min；进样量1μL(甲醇溶液)；分流比20∶1。质谱条件：离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；发射电流34.6μA；倍增器电压1294V；接口温度280℃；溶剂延迟5min；质量范围10-550u。结合Labsolution化学工作站检索，Nist147标准质谱图库检索出石斛碱化学结构。2、结果与分析2.1金钗石斛酶解条件的优化生物碱提取的传统方法是有机溶剂浸提法，利用浓度梯度使生物碱逐步扩散到溶剂中，消耗时间、溶剂用量多且操作繁琐。现在酶法提取已经广泛地应用于植物活性成分的提取，如酶法提取辣椒碱、小檗碱和长春碱等等。本实验试图通过酶法提取石斛碱最佳酶解条件的研究为石斛碱的提取提供一个新的方向。2、结果与分析2.1.1标准曲线的绘制图1.1石斛碱对照品的标准曲线2、结果与分析2.1.2酶解pH对石斛碱收率的影响•提取率(mg/g)•pH值图1.2pH值对酶解及石斛碱提取效率的影响2、结果与分析2.1.3酶解温度对石斛碱收率的影响•提取率(mg/g)温度（℃）•图1.3酶解温度对石斛碱提取效率的影响2、结果与分析2.1.4酶解时间对石斛碱收率的影响提取率(mg/g)•酶解时间（h）•图1.4酶解时间对石斛碱提取效率的影响2、结果与分析2.1.5酶用量对石斛碱提取率的影响•提取率(mg/g)•酶用量（mg/g）•图1.5酶用量对石斛碱提取效率的影响2、结果与分析小结•1）纤维素酶解石斛组织的最适条件为：酶用量7mg酶/g石斛粉、缓冲液pH5、酶解温度40℃、酶解时间2h。•2）在最适条件下，以乙醇回流提取酶解液，提取率为1.91mg/g，比非酶条件下直接提取率（1.91mg/g）提高了62%。2、结果与分析2.2纯度≥80%石斛碱粗品的获得2.2.1不同乙醇浓度对提取率的影响•图1.6不同乙醇浓度对石斛碱提取效率的影响2、结果与分析2.2.2不同固液比(乙醇用量)对提取率的影响•图1.7不同固液比对石斛碱提取效率的影响2、结果与分析2.2.3水相的pH值对二氯甲烷反萃取石斛碱的影响表1.1水相的pH值对二氯甲烷反萃取石斛碱的影响水相pH值5678910纯度(%)59.964.066.964.260.461.0回收率(%)56.268.587.795.998.398.32、结果与分析2.2.4石斛碱粗品的获得（84.0%）•图1.8二氯甲烷萃取水相中的石斛碱之薄层分析(TLC)•1：二氯甲烷相；2：萃取后的水相3：石斛碱对照品小结：•1）对酶解液浓缩物中石斛碱进行提取的最适条件为：75%的乙醇、固液比为1:12；•2）以2%HCl溶液萃取乙醇浸膏中的石斛碱，碱化后再以二氯甲烷反萃石斛碱的最适pH值为8；•3）1kg石斛粉原料在最优酶解、提取和纯化条件下可获得1.14g石斛碱粗品（纯度84.0%），回收率为79.8%。2.3高纯度石斛碱（纯度≥98%）的获得2.3.1硅胶柱层析分离获得纯度为90.3%的石斛碱•石斛碱•5CV6CV7CV8CV9CV10CV对照品对照品对照品•图1.9硅胶柱层析纯化石斛碱各洗脱组分的薄层分析(TLC)2.3高纯度石斛碱（纯度≥98%）的获得2.3.2重结晶获得纯度为98.4%的石斛碱表1.2石斛碱重结晶溶剂的选择结晶溶剂甲醇丙酮氯仿乙酸乙酯乙醚苯石油醚结果无结晶无结晶无结晶无结晶棕色晶体棕色晶体无结晶图1.10三次乙醚中重结晶后获得的石斛碱针状晶体•图1.11重结晶实验薄层分析•1：第三次析出的石斛碱晶体；2：石斛碱对照品；3：乙醚母液图1.12晶体石斛碱含量测定结果（气相色谱图）2.3.2重结晶获得纯度为98.4%的石斛碱•2.3.3气质联用法（GC-MS）确认石斛碱身份图1.13所制备的“石斛碱”质谱图小结1）以含量为82.5%的石斛碱粗品上硅胶柱进行一次层析分离，可获得纯度为90.3%的石斛碱，回收率为80.4%。2）以含量为84.0%的石斛碱粗品于乙醚中进行3次重结晶，可获得纯度为98.4%的石斛碱，回收率为19.8%。3）虽然结晶法的回收偏低（因为大量石斛碱残留于母液中），但是：1）采用结晶法获得的石斛碱纯度（98.4%）比柱层析法要高（90.3%）；2）结晶法避免使用了毒性较高的氯仿，具有相对环境友好的特点；3）结晶法的成本要远低于柱层析法（溶剂消耗量及回收能耗、吸附剂成本、时间、操作复杂性等）；4）若将3次结晶后的母液合并、适当除杂并浓缩后再次结晶可进一步提高回收率。3、结论以1kg干燥石斛原料（石斛碱含量0.45%）通过前述的纤维素酶解、醇提取、浓缩至浸膏（提取率3.3mg/g，纯度5.4%，回收率72%）、酸溶、碱化、二氯甲烷萃取、浓缩至粗品（纯度84%，回收率79.8%）和乙醚中重结晶（纯度98.4%，回收率19.8%）计算可获得0.512g石斛碱（纯度98.4%）。虽然最后乙醚重结晶步骤的回收率较低（~80%的石斛碱留于母液中），但若将3次结晶后的母液合并、适当除杂并浓缩后再次结晶可将回收率提高2倍以上。以此估算，以20kg石斛作为原料，按照本工艺提取和纯化，可获得20g以上98.4%的石斛碱。4、石斛碱生产工艺流程金钗石斛干燥茎段粉碎过80目筛加入酶液，40℃，搅拌，酶解2h石斛粉质量0.7%的固定化纤维素酶（活力≥10000U/），溶于石斛粉质量3倍体积的pH5缓冲液升温至90℃10min灭酶按固液比1:12加入乙醇，调整使乙醇终浓度为75%加热回流提取3h加热回流3h过滤，滤渣再用6倍体积75%乙醇回流1h过滤，合并滤液真空浓缩至浸膏（相对密度1.2）2倍体积2%HCl搅拌，沥出提取液，重复提取1次，合并提取液等体积二氯甲烷萃取3次，回收二氯甲烷剩余酸液用氨水调至pH8等体积二氯甲烷萃取2次，回收二氯甲烷二氯甲烷萃取物（石斛碱粗品）加入粗品20倍体积的乙醚，溶解置0℃以下进行结晶晶体、同样条件下重结晶2次回收母液石斛碱产品（≥98%）萃取除杂二、金钗石斛功能食品研制1、金钗石斛红枣饮料（澄清型）的研制2、金钗石斛绿豆饮料（浑浊型）的研制3、金钗石斛系列彩色面条的研制4、金钗石斛胶囊的研制1、金钗石斛红枣饮料（澄清型）的研制•1.1材料与方法1.1.1材料与设备试验材料：一年生金钗石斛茎购自贵州省赤水市金钗石斛GAP种植基地，经测定石斛碱含量为0.48%（干重），优质市售红枣。主要试剂：果胶酶，明胶，单宁，白砂糖，蜂蜜，乙基麦芽酚，Vc，异抗坏血酸，尼泊金乙酯，食用酒精。主要设备：万能粉碎机FW-400A，不锈钢夹层锅，硅藻土过滤机，真空脱气机或旋转蒸发仪，超高温瞬时杀菌（UHT）机，无菌灌装系统，手持糖度计，分光光度计，浊度计。1.1.2方法1.1.2.1石斛碱含量按照“1.2.1石斛碱含量测定方法”进行1.1.2.2理化指标和微生物指标按照国家标准“GB/T31121-2014果蔬汁类及其饮料”所规定或引用的方法进行分析。1.1.2.3可溶性固形物含量的测定用手持糖度计或波美比重计测定，平行测定3次。1.1.2.4透光率的测定在625nm处，用蒸馏水作空白，测定透光率，表示饮料汁的澄清度。1.1.2.5浊度（NTU）的测定用浊度计测定，平行测定3次。1.1.2.6感官评定方法采用综合评分方法，对金钗石斛红枣饮料的口感风味、香气和色泽进行评价，满分以100分计，随机选定10位老师，男女各半，品评鉴定后按表2.1感官评定进行打分。1.2结果与分析1