抗菌肽基因工程表达技术研究进展

抗菌肽基因工程表达技术研究进展作者：付登峰，胡建和，刘兴友，FUDeng-feng，HUJian-he，LIUXing-you作者单位：河南科技学院动物科学学院,新乡,453003刊名：中国畜牧兽医英文刊名：CHINAANIMALHUSBANDRY&VETERINARYMEDICINE年，卷(期)：2010，37(9)被引用次数：0次参考文献(14条)1.仇妍虹.李鹏.李斐.郑其升.曹瑞兵.周斌.陈德胜.陈溥言重组家蝇抗菌肽Des-HF在酵母中的表达及对金黄色葡萄球菌的抗菌活性2009(1)2.尹娜.李鸿钧.彭梅.谢天宏.张光明.施锐.孙茂盛抗菌肽CecropinD在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定2008(3)3.王桂荣.严作廷.王东升.米宝明.崔燕乳牛子宫内膜抗菌肽BNBD5基因的克隆及其原核表达2009(6)4.刘静.刘聚祥果蝇抗菌肽的合成及在毕赤酵母中的表达20085.孙琦.孙爱华.严杰抗菌肽Alloferon-1串联式重组表达及其表达产物体外抗肿瘤活性的研究2008(1)6.HongIP.LeeSJ.ChoiSGRecombinantexpressionofhumancathe-licidin(hCAP18/LL-37)inPichiapastoris2007(1)7.PengL.XuZ.FangXHigh-levelexpressionofsolublehumanβ-defensin-2inEscherichiacoli2004(12)8.RaoX.HuJ.LiSDesignandexpressionofpeptideantibiotichPAB-betaastandemmuhimersinEscherichiacoli2005(5)9.SteinerHD.HultmarKA.EngstroMHSequenceandspecificityoftwoantibacterialproteinsinvolvedininsectimmunity198110.周洪波.皮灿辉.彭永鹤.苏向东.李永新抗菌肽在调节动物免疫力方面的研究进展2009(7)11.谢芳.韩文瑜.雷连成.韩俊友.胡博牛蛙皮肤抗菌肽Ranalexin基因的原核表达及其抑菌活性2009(1)12.韩宗玺.马得莹.刘胜旺.李一经重组鸡抗菌肽Gallinacin-9的原核表达及其抗菌活性的鉴定2008(10)13.蔡晶晶.杨明.蔡灵.郭庆.潘瑞珍.王克坚黑鲷抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性2009(5)14.BrahmacharyM.KrishnanSP.KohnAntimic:adatabaseofantimicrobialsequences2004(Databaseissue)相似文献(10条)1.期刊论文赵红霞.詹勇.许梓荣动物抗菌肽及其基因工程-江西饲料2002(5)抗菌肽(antibacterialpeptides)是具有抗菌活性的肽类的总称.目前发现抗菌肽或类似抗菌肽的小分子肽类广泛存在于昆虫、两栖类、水产动物及哺乳动物中,这种内源性抗菌肽经诱导而合成,在机体抵抗病原的入侵方面起着重要的作用.本文介绍了各种动物抗菌肽的来源和种类,抗菌肽的作用及其机理,抗菌肽的结构对其活性的影响关系;最后,介绍了抗菌肽基因工程方面的研究进展及其应用前景.2.学位论文王利娜杂合抗菌肽Attacin-Thanatin基因工程表达菌的构建及重组抗菌肽的生物学功效2009本研究旨在构建杂合抗菌肽AT基因的基因工程表达菌，并分别在原核和真核细胞中表达；通过体内、体外抑菌试验、以小鼠为模型的活体试验初步探讨重组抗菌肽AT的生物学功效。首先通过RT-PCR技术，从大肠杆菌攻毒诱导的果蝇中扩增AttacinA基因，通过SOE-PCR技术结合TD-PCR将编码成熟肽的AttacinA基因（简写为mA）与Thanatin基因首位相连连接在一起形成杂合基因Attacin-Thanatin（简写为AT），构建原核、真核重组表达菌，表达重组杂合抗菌肽AT及mA。利用宿主菌对抗菌肽分子内源攻击的敏感性，即表达的抗菌肽对宿主菌有抑制作用、从而造成宿主菌的部分“自杀”这一原理，建立体内活性检测方法并利用该方法检测杂合抗菌肽AT的体内抑菌活性，同时对原核表达产物初步纯化后进行体外抑菌试验。为了考察重组抗菌肽在活体上的生物学功效，以小鼠为模型初步探讨了真核表达产物在调控生产性能、免疫功能及肠道形态上的效果。主要研究结果如下：1、采用二步法RT-PCR技术，克隆出了AttacinA基因，电泳分析显示，其条带大小约为732bp，与预期片段大小相符，测序结果表明，其核苷酸序列与GenBank报道的AttacinA基因同源性高达96％～99％以上，证实已经正确克隆获得AttacinA基因。序列分析显示，该基因完整阅读框包含666bp，编码221AA。2、以重组TA克隆质粒pMD-AttA为模板，经两次SOE-PCR技术结合TD-PCR扩增后，扩增出杂合肽基因AT片段大小约为660bp。该杂合基因以AttacinAN端的189AA作为N端，C端为ThanatinC端的18AA，中间有6AA柔性接头，总共包含213AA。3、成功构建杂合基因AT及mA的原核重组表达载体pET-mAT（pe）、pET-mA（pe），转化宿主菌Rosetta-gamiTM（DE3）pLysS，经过IPTG诱导后，SDS-PAGE电泳分析显示，在41．8kDa、39．2KDa处有明显的目的条带，与预期目的蛋白分子量理论值一致，表明Rosetta-gamiTM（DE3）pLysS可成功表达AT、mA抗菌肽。4、将重组表达载体pET-mAT（pe）依次转化宿主菌E．coliDH5α、BL21（DE）、Rosetta-gamiTM（DE3）pLysS，采用IPTG诱导表达；通过优化选择该抗菌肽的敏感菌株、诱导剂IPTG浓度、宿主菌诱导起始浓度等初步建立抗菌肽菌内抑菌活性检测方法，并研究了该杂合抗菌肽体内抑菌活性。结果表明以E．coliDH5α为宿主菌、0．1mmol/LIPTG为工作浓度、D（600nm）值0．3为起始诱导菌浓度检测抗菌肽菌内抑菌活性方法合理可行；AT融合表达产物抑菌活性检测显示，宿主菌E．coliDH5α被本身所表达的杂合抗菌肽所抑制，增殖速度明显较对照菌放缓。5、本试验采用Nj2+-NTAagarosebeads通过His标签纯化目的蛋白，并初步探讨了该抗菌肽的抑菌活性。结果表明，本试验所获得的抗菌肽AT及mA对E．coliDH5α、E．coliBL21（DE3）、猪霍乱沙门菌、金黄色葡萄球菌具有抑菌活性，其中对大肠杆菌最为敏感。溶血试验表明，其对猪的红细胞几乎没有溶血活性。6、为了检测AT及mA在哺乳动物Vero细胞中的表达特点，试验首先构建增强型绿色荧光蛋白EGFP重组报告载体，通过对细胞绿色荧光的观察来确定该基因在哺乳动物细胞中表达的可行性及表达规律。结果显示，构建的重组真核报告表达载体pEGFP-mAT（ee）、pEGFP-mA（ee），转染到哺乳动物细胞Vero中后，AT及mA基因均可在Vero细胞中获得绿色荧光蛋白融合表达产物，72h时融合蛋白表达量最大，绿色荧光定位观察显示，表达的融合蛋白可以分泌到细胞外。试验进一步构建了重组真核表达载体pCI-mAT（ee）、pCI-mA（ee），转染到Vero细胞中进行表达。根据上述表达特点在转染后72h检测表达结果，SDS-PAGE电泳显示在23．54kDa、20．9kDa处出现目的蛋白条带，大小与预期蛋白分子量理论值基本一致，说明杂合抗菌肽AT及抗菌肽mA均可在Vero细真核胞中获得纯表达。同时收集细胞培养液上清备用。7、通过检测细胞培养液上清对受试菌株的抑菌活性，发现高浓度细胞培养液上清较低浓度的能够更好地抑制细菌的生长，说明该上清中含有目的抗菌肽，可以作为进一步小鼠试验研究的素材。8、选择80只3～4周龄、平均体重为14．2±1．03g（平均数±标准差）的断奶小鼠随机分为4组，每组5个重复，连续7天腹腔注射含有抗菌肽AT、mA的细胞培养液上清，正常细胞的培养液上清、氨苄西林作为对照。于第8天大肠杆菌攻毒后继续饲养一周。我们发现连续7天腹腔注射含有抗菌肽AT及mA的细胞培养液上清后，AT杂合抗菌肽组小鼠的日增重较其他3组均略有提高，分别比mA组、细胞培养液上清及抗生素组提高了14．7％、13．8％及12．1％，但差异均不显著。而mA组与细胞培养液上清及抗生素组几乎没有差异。攻毒后的一周内，AT杂合抗菌肽组小鼠的生长性能则分别较mA组、细胞培养液上清及抗生素组提高了34．18％、53．62％及17．78％，其中与细胞培养液上清对照组相比差异达到显著水平（p0．05）。从试验全期来看，AT杂合抗菌肽组小鼠的日增重与mA组及细胞培养液上清组比较明显提高（p0．05），提高幅度达25％，而与抗生素组差异不显著。连续腹腔注射重组蛋白后．发现其对胸腺、脾脏的相对重量、十二指肠的绒毛高度没有影响，却极显著增加了空肠的绒毛高度，mA组、AT杂合抗菌肽组小鼠分别较细胞培养液上清组升高了77．4％、74．2％（p0．01）。对十二指肠隐窝深度有一定的改善，mA组、AT杂合抗菌肽组小鼠分别较细胞培养液上清组下降了16．99％（p0．01）、11．12％（p0．05）。攻毒后，与对照组相比，重组抗菌肽组小鼠十二指肠、空肠的隐窝深度均较对照组降低，其中AT及mA组小鼠十二指肠隐窝深度分别较抗生素组降低了11．3％（p0．05）、15．38％（p0．01）；空肠隐窝深度分别较抗生素组降低了4．8％、7．14％，差异均不显著。注射重组抗菌肽后，小鼠血清中的免疫球蛋白IgM、IL-1β的水平明显提高，而攻毒后，IL-1β的水平较对照组下降。结论：本研究成功构建了抗菌肽基因AT、mA的原核、真核基因工程表达菌，并通过体内、体外试验表明了重组抗菌肽AT、mA对大肠杆菌、猪霍乱沙门菌、金黄色葡萄球菌等具有抑菌活性，其中对大肠杆菌最为敏感；通过以小鼠为模型的活体试验证明了该重组抗菌肽在调控小鼠的生产性能、免疫功能及肠道形态上具有较好的生物学功效。3.期刊论文王海静.王福生.边艳青.赵宝华.WANGHai-jing.WANGFu-sheng.BIANYan-qing.ZHAOBao-hua水产动物基因工程抗菌肽及其应用前景的研究-水生态学杂志2009,2(3)抗菌肽是水产动物体内非特异性免疫系统的第一道防线,在抵御外来病原微生物的过程中发挥着重要作用.来源于鱼、虾、蟹等水产动物的抗菌肽杀菌作用更强,溶血效应小,种类多样化,显示出比其它种类更具优势的应用前景.介绍了一些水产动物抗菌肽的研究近况、基因工程研究进展以及转抗菌肽基因在水产动物中的研究进展,并展望了其在水产领域的应用前景.4.期刊论文宋家清.廖富蘋.黄旭华.叶可可昆虫抗菌肽基因工程研究进展-生物技术通报2004(2)昆虫抗菌肽对细菌、真菌、病毒和原虫都具有杀灭作用,甚至对肿瘤细胞也具有杀伤作用.昆虫抗菌肽并且有独特的作用机制,成为众多表达系统外源导入基因的侯选对象之一,综述了昆虫抗菌肽的种类及其在微生物转基因工程和植物转基因工程中的进展.5.期刊论文赵建乐.李引乾.陈琛.闫茂仓.田泽华.张晶艳.张小莺.ZHAOJian-le.LIYin-qian.CHENChen.YANMao-cang.TIANZe-hua.ZHANGJing-yan.ZHANGXiao-ying牛抗菌肽及其基因工程的研究进展-中国兽医科学2010,40(8)综述了牛抗菌肽在分类、组织分布、生物活性、基因结构等方面的研究进展,对采用基因工程技术表达牛抗菌肽的方法进行了评述,并展望了其转基因技术的应用前景,提出了利用生物信息学构建牛抗菌肽肽库的新思路.6.期刊论文冯兴军.王建华.单安山.FENGXing-jun.WANGJian-hua.SHANAn-shan抗菌肽基因工程研究及其表达策略-中国生物工程杂志2006,26(3)抗菌肽广泛