04痰培养标准化操作经验分享-卢先雷XXXX1013

痰培养标准化操作经验分享（微生物之家论坛巴斯德之徒）卢先雷痰培养标准化操作流程样本接收痰液洗涤压片法制片染色镜检肉眼筛选分类镜下筛选痰液消化痰液接种首代培养目标菌落选取鉴定药敏综合报告样本接收样本标识与病人基本信息申请单内容与样本类型核对样本外观与容器密封性检查肉眼筛选合格标本：黄色、灰色、血性、铁锈色，浑浊、稠厚，呈现团块状的标本；不合格标本：无色、白色、有黑色小点，清稀，呈现泡沫状，有明显食物渣滓、纸屑灰尘、泥土的标本。混合性标本：既有脓性成分又有唾液成分的痰标本痰液——不合格标本来自口腔咽喉的分泌物，主要成分是唾液。含大量上皮细胞，正常菌群。透明清稀泡沫状痰液——合格标本来自下呼吸道，主要成分是脓细胞、渗出的粘蛋白和感染菌浑浊、脓性膏状痰液——合格与不合格的外观比较合格不合格痰液——混合性样本存在严重的取样误差，挑取脓性部分和唾液部分其检验结果可能完全不同：唾液成分中存在定植菌，而感染菌只存在于脓性成分中。镜下筛选混合性标本：先进行洗涤，分离出脓性成分，再镜检脓细胞25/HP且复层鳞状上皮10/LP的标本为合格标本，可进入下一步程序；而脓细胞10/HP或复层鳞状上皮25/LP的标本为不合格标本，应拒收。儿科痰标本：直接镜检做细胞学筛查痰液洗涤按《全国临床检验操作规程》（第二版）相关章节，采用先用20ml生理盐水洗涤两次，再加入10ml生理盐水稀释视屏：压片法制片视屏：改良手法革兰染色视屏：显微镜检验镜检原理：*免疫学原理镜检方法：先低倍镜再油镜，收寻20~30个视野中脓细胞聚集处，集中而不稠密，且周围无鳞状上皮细胞或无大量成团状分布的细菌球的区域为读片区镜检内容：认真收寻脓细胞胞浆中有无吞噬的细菌，或者结节状脓细胞团块中有无菌丝的包裹，记录细菌的染色排列特征，菌体特征（如粗细、长短、扭曲）注意区分粘附于吞噬注意辨认经抗生素治疗后形态变异了的细菌（小球体、巨球体、丝状体、斑驳染色）*镜检的免疫学原理人体生理腔道粘膜中、粘膜下，以及无菌部位分布的免疫细胞细胞膜上的Toll样受体种类及分子多态性程度不同。粘膜中，由于菌群建立过程，伴随着免疫耐受过程的形成，这些部位Toll样受体种类相对单一，分子多态性程度低，可识别的异源性分子种类少，因而对多数正常菌群产生免疫耐受，表现为无应答粘膜下以及无菌部位免疫细胞细胞膜上Toll样受体种类繁多，分子多态性程度高，可识别的异源性分子种类多，对几乎所有侵入粘膜下以及无菌部位的微生物均可产生免疫应答。当机体被微生物感染时，就会激发机体的免疫系统，从而产生免疫应答。由于Toll样受体识别病原体后，会启动胞内信号转导，从转录水平调控受体蛋白的表达——该过程称为克隆激活。因而经过激活的一个中性粒细胞只能识别一种病原体。在细菌和真菌的感染中，侵袭性感染是最主要的感染类型。人体对侵袭性感染的主要免疫机制就是细胞渗出——包括早期的固有免疫（中性粒细胞的浸润）和后期的适应性免疫（免疫调理和细胞毒作用）整个过程都始终贯穿着白细胞的趋化、包裹、吞噬、消化等过程胞内吞噬、多细胞包裹是易于辨认的具有重要意义的免疫现象只要观察白细胞与微生物之间的“斗争”，我们就能正确区分“敌我双方”关系因而，具有吞噬和包裹现象的微生物就是感染菌。无吞噬现象的则可能为定植菌，也可能为感染菌（例如感染早期产生荚膜的细菌具有抗吞噬作用）对于产荚膜的细菌/真菌，总是有荚膜低表达和无荚膜的个体，这些个体能被发现与细胞中（详细请参考微生物之家论坛=4&Id=19895）后期当有针对荚膜的特异性抗体产生时，即使有荚膜也能被吞噬观察吞噬和包裹现象是行之有效的鉴别定植菌与感染的一种手段吞噬及溶菌过程容易发生不完全吞噬通常只发生完全吞噬影响吞噬的因素Toll样受体与配体——白细胞的激活与识别能力抗体与补体——调理作用，增强吞噬与溶菌细菌/真菌荚膜——抗吞噬细菌III型分泌系统分泌的效应蛋白——导致被动吞噬以及不完全吞噬促使淋巴细胞释放细胞因子，诱导白细胞凋亡真菌毒素直接抑制吞噬与溶菌，干扰调理作用涂片镜检区分定植菌与感染菌的方法实践吞噬与粘附：G+球菌位于细胞核上，与细胞不在同一层面；G-杆菌与细胞位于同一层面，且在胞浆中，周围有微弱淡染区。因而G+球菌判断为粘附，G-杆菌为吞噬。定植与粘附的区别要点细菌与细胞核位于同一平面细菌位于胞浆内，而不是胞核上（溶酶体只存在于胞浆中）；胞内细菌一般为单一种类；当出现多种细菌形成的细菌球时，肯定是粘附（中性粒细胞的克隆激活原理）；细菌周围有一圈不着色或着淡红色的晕圈；G+细菌染色偏淡，甚至着色不均（斑驳染色）；胞内细菌形态往往有不同程度改变；真菌胞内吞噬具有明显的占位现象；着色较差；杆菌或链球菌一截在内，一截在外时，肯定是粘附；吞噬菌与优势菌病人为CAP老年患者优势菌为肺炎链球菌、大肠埃希菌吞噬菌为卡他莫拉菌吞噬菌与优势菌的差别吞噬菌即为感染菌，却不一定是优势菌，很多时候量少反而有临床意义；优势菌不一定是感染菌，很多时候量多反而无临床意义；结核杆菌数十个视野发现一条都有价值，没人会认为它是定植菌；而草绿色链球菌、奈瑟菌在口腔尽管多数时候是优势菌但却被公认为无价值菌群。利用激活原理及概率法判断菌群污染较重标本中的感染菌步骤1：搜寻脓细胞胞浆中有疑似吞噬的视野，寻找其中细菌单一的吞噬细胞步骤2：计数20-100个有吞噬或者无法区分粘附的脓细胞，计算吞噬单一细菌的细胞出现的概率，占（吞噬+粘附）总数的30%以上即可认定为感染菌案例1单一吞噬数=3吞噬+粘附=4概率值75%单一吞噬数=3吞噬+粘附=5概率值60%单一吞噬数=0吞噬+粘附=1概率值0%单一吞噬数=5吞噬+粘附=7概率值71%单一吞噬数=1吞噬+粘附=3概率值33%案例1累积概率吞噬+粘附=4+5+1+7+3=20单一吞噬=3+3+0+5+1=12单一吞噬总概率=12/20=60%＞30%即单一吞噬之小杆菌为感染菌，可能是流感杆菌。案例2WBC＞25/LPSEC＞10/LP灰区样本！1/63/51/24/63/5案例2累积概率单一吞噬=12吞噬+粘附=24单一吞噬累积概率=12/24=50%＞30%即单一吞噬之G-粗大杆菌为感染菌，可能是肠杆菌科细菌痰培养中常见感染菌直接涂片镜下特点肺炎链球菌流感嗜血杆菌流感杆菌L型流感杆菌L型流感与肺链混合感染卡他莫拉菌金黄色葡萄球菌消化链球菌结核分枝杆菌肺炎克雷伯菌大肠埃希菌铜绿假单胞菌粘液型铜绿鲍曼不动杆菌奥斯陆莫拉菌星形奴卡菌（痰）新型隐球菌烟曲霉菌（痰）核固缩核碎裂肺曲霉病患者痰液中性粒细胞的退行性变痰液的消化胰蛋白酶：1~2%的无菌PBS或生理盐水溶液二硫苏糖醇（DTT）：0.1%生理盐水溶液N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）：5%生理盐水溶液痰液的接种培养基基本组合：血平板、巧克力培养基（含万古霉素）、麦康凯、CHROMagar；特殊补充：怀疑为军团菌的加种BCYE-а培养基怀疑为百日咳的加种Boudet-Gengou培养基怀疑为肺炎支原体感染的加种Hayflick双相培养基怀疑为结核的接种L-J培养基或Middlebrook7H-10痰培养环境苛养菌：35℃，5%CO2环境，相对湿度＞70%普通细菌：35℃，普通大气环境，相对湿度＞70%丝状真菌:28℃，普通大气环境，相对湿度＞80%读碟：目标菌落选取结合镜下特征与菌落特征综合分析挑选菌体特征与菌落特征一致的细菌作为目标菌，作传代纯培养和进一步的鉴定药敏举例：病例1：流感嗜血杆菌举例：病例2：肺炎链球菌举例：例3：烟曲霉菌纯培养技术选择分离状态相对较好的单个菌落先用接种针挑取菌落顶端，在适当的固体培养基原始区轻轻划线，并转动接种针，使菌落蘸到培养基表面再用接种环分区划线细菌鉴定与药敏试验细菌鉴定定向试验系统鉴定定向试验G-杆菌+麦康凯生长氧化酶+OF试验*（-F）→肠杆菌*（+F）→弧菌*（+/-O/N）→非发酵菌CO2促进生长含万古霉素巧克力培养基生长血平板CO2环境生长*（++-）→嗜血杆菌→V、X因子需求或卫星试验*（-++）→HACEK族细菌等苛养性G-杆菌*（+++）→二氧化碳嗜纤维菌*（--+）→黄杆菌相关属G-杆菌+麦康凯不生长G+杆菌+麦康凯不生长+拉丝试验阴性触酶芽孢动力*(+--)→棒状杆菌→异染颗粒*(+-+)→李斯特菌→CAMP、4℃冷增菌、半固体*(+++)→芽孢杆菌*(---)→乳杆菌G+球菌+麦康凯不生长+拉丝试验阴性触酶OF试验溶血*（+,F,β/γ）→葡萄球菌属→血浆凝固酶*（+,O/N,γ）→微球菌属*（-,F,α/β/γ）→链球菌科细菌→Lancefied抗原乳胶凝集肺炎链球菌乳胶凝集凝固酶阳性葡萄球菌凝固酶阴性葡萄球菌CHROMagar生长，酵母样菌落显微镜观察：真菌孢子*酵母样真菌→血清芽管诱导玉米吐温28℃霉菌相诱导→乳酸酚棉兰染色脑心浸液琼脂酵母相诱导尿酶试验小心：1、痰培养中双相真菌要当心马尔尼菲青霉菌2、球形孢子，出芽，生长缓慢，尿酶阳性=新型隐球菌系统鉴定试验组合*肠杆菌科*非发酵菌*葡萄球菌与微球菌*链球菌科*嗜血杆菌*酵母样真菌*棒状杆菌及相关属GNGPNHANC痰培养常见细菌商品化鉴定系统：注意：丝状真菌、放线菌（厌氧）、奴卡菌、NTM这些痰培养中容易碰到的病原体没有商品化鉴定系统可用——传统手工方法仍然不能抛弃！系统鉴定前的准备*仪器的准备*试剂的准备*菌悬液的准备——必须是由经过纯培养的菌落或者分离状态较佳的单个菌落制备，禁止使用混合菌！*选择恰当的接种浓度：*碳源氮源利用试验、同化试验、生长以及生长抑制试验采用采用低接种浓度*糖分解、氨基酸分解（脱羧/脱氨）、蛋白质分解、吲哚产生等，以及各种酶试验采用高接种浓度*苛养菌酶法快速生化试验采用浓厚接种，糖类需覆盖石蜡鉴定方法选择*手工试验：微量生化管、API系列*半自动：ATB（32种）、Autoscan、国产鉴定系统（上海复兴、珠海迪尔、珠海美华、山东新科、合肥恒星、温州康泰、杭州天和等15~30种）*全自动：*梅里埃V2C（60种）*BDphoenix100（45种）*西门子MicroscanwalkAway-96（30种）生化反应结果的判读*正确的孵育温度、湿度*除特殊需要CO2的细菌外一般置普通35℃孵箱*真菌28℃孵育，注意保湿*有些细菌22℃与35℃试验结果不同，按鉴定试剂盒规定的温度孵育否则易得出错误结果*正确的孵育时间*粘液性铜绿必须48h读取结果，其他非发酵菌最佳孵育时间为48h*真菌同化试验必须48h读取结果*正确的判读方法*主要是微量生化管，以及鉴定板对弱阳性孔的解读药敏试验*手工：*纸片扩散法*MIC法*E-test法*琼脂稀释法*半自动与全自动：*简化双浓度折点法：ATB药敏*简化常规浓度分布MIC法：Phoenix100、Microscan、Autoscan、国产半自动*动力学计算MIC法：VITEK2药敏综合报告未染色标本直接涂片结果：有无脓细胞、脓细胞数量、上皮细胞数量、二者比例、有无真菌孢子／菌丝、有无寄生虫等Gram染色镜检结果：包括脓细胞数量、上皮细胞与胞外正常菌群数量与污染程度、脓细胞胞内吞噬细菌／真菌孢子的情况，炎性包裹物内细菌和真菌的存在情况、脓细胞和炎性包裹物内的细菌／真菌的染色特征、形态特征和排列特征细菌鉴定结果、特殊耐药机制、药敏试验测试结果检验结果与临床诊断和治疗相关性的评述与建议病人基本信息直接涂片结果涂片染色结果培养鉴定结果、特殊耐药机制、菌落计数结果药敏结果临床评注备注信息关于痰培养的阴性报告不合格标本：最好：退回去。或者：直接涂片：鳞状上皮＞25/LP，白细胞＜10/LP，提示标本为唾液。涂片染色：白细胞内未见明显细菌吞噬细菌培养：未分离出致病菌合格但未见吞噬标本：直接涂片：可见较多