大肠菌群检测操作规范培训

大肠菌群检测操作规范培训质量管理部目录一、细菌介绍二、大肠杆菌生物学特性三、大肠杆菌检测仪器、设备四、检测培养基及试剂五、检测前培养基准备六、接种培养七、MPN单位介绍八、检测注意事项一、细菌介绍细菌是单细胞原核微生物，个体微小（细胞直径约0.5μm,0.5-5μm），结构简单，以二等分裂方式繁殖。在自然界中，细菌分布最广、数量最多。1、细菌的形态细菌个体微小、形态各异球菌杆菌弧菌与弯曲菌螺旋菌及螺旋体不规则形弧菌2、细菌的结构细菌的基本结构包括：细胞壁、细胞膜、间体、细胞浆、核糖体、细胞质。细菌的附属结构包括：质粒、荚膜、鞭毛、菌毛和芽胞。3、细菌的繁殖细菌最普遍、最主要的繁殖方式：二分分裂繁殖。在分裂前先延长菌体，染色体复制为二，然后垂直于长轴分裂，细胞赤道附近的细胞质膜凹陷生长，直至形成横隔膜，同时形成横隔壁，这样便产生两个子细胞。4、细菌的菌落单个或少数细菌细胞生长繁殖后，会形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定形态构造的子细胞集团－菌落。细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等。细菌的菌落图二、大肠杆菌生物学特性大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要包括埃希氏菌、柠檬酸细菌、肠杆菌、克雷伯氏菌等，均属于肠杆菌。大肠菌群以大肠埃希氏菌为主，是革兰氏阴性、两端钝圆的杆菌，无芽孢，以周生鞭毛运动或不运动。最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。1、大肠杆菌平板菌落照片2、大肠杆菌革兰氏染色照片3、大肠杆菌微菌落照片4、大肠杆菌透射电镜照片5、大肠杆菌扫描电镜照片6、大肠杆菌分裂照片三、检测仪器、设备冰箱：0～4℃恒温培养箱：36±1℃恒温水浴锅：46±1℃微生物显微镜架盘药物天平：0g～500g，精确至0.5g三角瓶：500ml灭菌吸管：1ml、10ml灭菌平皿：直径90mm试管：18×180mm四、检测培养基及试剂乳糖胆盐发酵管伊红美蓝琼脂乳糖发酵管革兰氏染色液生理盐水乳糖胆盐发酵管：用于大肠菌群的测定。35g乳糖胆盐于1升蒸馏水中，溶解，分装于发酵试管中，放入小倒管，115℃15分钟高压灭菌。双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其它成分加倍。乳糖发酵管：大肠菌群证实试验用。30g乳糖于1升蒸馏水中，溶解，分装于发酵试管中，放入小倒管，115℃15分钟高压灭菌。伊红美兰琼脂：用于大肠菌群的固体平板检测。37.5g于1升蒸馏水中，摇匀，加热煮沸，121℃15分钟高压灭菌。五、检测前培养基准备检查预先经过灭菌处理的乳糖胆盐发酵培养基小导管内是否有气体。按产品品种将培养基分别放在试管架内，同时将9ml0.85%灭菌盐水管也放入相应的试管架内。六、接种培养（一）酸牛奶系列产品酸牛奶系列产品接种单料乳糖胆盐发酵培养基9支管，分别接种样品量为1ml(原浓度)3支，0.1ml(10-1浓度)3支，0.01ml(10-2浓度)3支。1、1ml接种培养在无菌条件下，用1ml灭菌吸管吸取1ml样品试液于含有9ml0.85%灭菌盐水试管中，振荡摇匀制成1:10的稀释液；同时分别吸取1ml样品试液于3支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。2、0.1ml接种培养另换1根1ml灭菌移液管吸取1:10的稀释液1ml于含有9ml0.85%灭菌盐水试管中，振荡摇匀制成1:100的稀释液；同时分别吸取1ml1:10稀释液于3支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。3、0.01ml接种培养另换1根1ml灭菌移液管分别吸取1ml1:100稀释液于3支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。4、接种过程操作录像检测\单料大肠检测.MPG5、接种后培养将接种完的试管连同试管架一起置于36±1℃的培养箱内培养24±2h，观察乳糖胆盐发酵管的变化情况。6、结果查询并记录若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则报告大肠菌群阴性。若有产酸产气，则要做证实试验。（二）活性乳酸菌饮料系列产品活性乳酸菌饮料系列产品接种双料乳糖胆盐发酵培养基3支管，单料乳糖胆盐发酵培养基6支，分别接种样品量为10ml3支，1ml3支，0.1ml3支。1、10ml接种培养在无菌条件下，用1ml灭菌吸管吸取1ml样品试液于含有9ml0.85%灭菌盐水试管中，振荡摇匀制成1:10的稀释液；同时用10ml灭菌吸管分别吸取10ml样品试液于3支双料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。2、1ml接种培养另用1ml灭菌移液管分别吸取1ml样品试液于3支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。3、0.1ml接种培养另换1根1ml灭菌移液管分别吸取1ml1:10稀释液于3支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。4、接种过程操作录像检测\双料大肠检测.MPG5、接种后培养将接种完的试管连同试管架一起置于36±1℃的培养箱内培养24±2h，观察乳糖胆盐发酵管的变化情况。6、结果查询并记录若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则报告大肠菌群阴性。若有产酸产气，则要做证实试验。（三）证实试验1、伊红美蓝琼脂平板分离将产酸产气乳糖胆盐发酵管内的培养物分别接种于伊红美兰琼脂平板(划线分离)，置于36±1℃的培养箱内培养24±2h。接种和分离工具1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀平板分离画线法1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法将伊红美蓝琼脂平板从培养箱取出后,观察菌落形态，并做革兰氏染色和乳糖复发酵试验。革兰氏染色：见《革兰氏染色及镜检操作规范》。（四）乳糖发酵试验挑取可疑菌落进行革兰氏染色后接种乳糖发酵培养基，置于36±1℃的培养箱内培养24±2h，观察产气情况。凡是革兰氏阴性无芽孢杆菌乳糖发酵管产酸产气的菌落即可报告大肠菌群阳性。根据证实为大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，查找每100ml样品内的大肠菌群的MPN值。将检测结果填入《微生物检测报告单》，并及时传递给相关部门。七、MPN单位介绍MPN=MostProbableNumber，最大可能数，是一种利用统计学检测微生物的方法。食品大肠菌群是以每克或100ML中大肠菌群的最近似值，是用MPN来表示。采用9管法，对样品选三个稀释度，每个稀释度接种三管相应的培养基进行培养，然后根据情况做出判断阳性和阴性，再根据不同稀释度的阳性管数查表即可得到被测样品相应指标的MPN值。八、注意事项乳糖胆盐发酵管内小导管内如无气泡，需轻振试管，若有气泡上冒，也算产气。在伊红美蓝琼脂平板上的菌落如为深紫色有金属光泽，则为典型菌落，98%以上为大肠菌群。革兰氏染色和乳糖复发酵时如有典型菌落，则挑取典型菌落；无典型菌落，应挑取红色和粉色菌落。如果只有红色或粉色菌落，应挑取3个进行革兰氏染色，并接种乳糖发酵培养基。如果有红色和粉色菌落，则各挑取3个做革兰氏染色，各挑取3个接种乳糖发酵培养基混合接种。