JJF(晋）59-2021 实时荧光定量聚合酶链反应分析仪校准规范

JJF（晋）59-2021本规范主要起草人：管立江（大同市综合检验检测中心）任小虎（大同市综合检验检测中心）宋亚琳（大同市综合检验检测中心）参加起草人：王芬（大同市综合检验检测中心）姚文军（大同市综合检验检测中心）薛诚（北京林电伟业电子技术有限公司）闫闻（大同市综合检验检测中心）JJF（晋）59-2021I目录引言..........................................................................................................................II1.范围..........................................................................................................................12.引用文件..................................................................................................................13.术语..........................................................................................................................14概述............................................................................................................................35计量特性..................................................................................................................36校准条件....................................................................................................................47校准项目和校准方法................................................................................................58校准结果表达........................................................................................................119复校时间间隔........................................................................................................11附录A荧光定量PCR仪校准原始记录参考格式......................................................13附录B荧光定量PCR仪校准证书内页参考格式......................................................16附录C温度偏差和阈值循环数示值误差测量结果的不确定度评定示例............17JJF（晋）59-2021II引言本规范依据JJF1001-2011《通用计量术语及定义》、JJF1071-2010《国家计量校准规范编写规则》起草，其中测量不确定度的评定按照JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》进行。本规范采用了JJF1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》、YY/T1173-2010《聚合酶链反应分析仪》相关术语定义和技术内容。本规范为首次制定。JJF（晋）59-20211实时荧光定量聚合酶链反应分析仪校准规范1.范围本规范适用于实时荧光定量聚合酶链反应分析仪的校准。2.引用文件YY/T1173-2010《聚合酶链反应分析仪》JJF1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》JJF1101-2019《环境试验设备温度、湿度参数校准规范》凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本规范；不注日期的引用文件,其最新版(包括所有的修改版)适用于本规范。3.术语3.1聚合酶链反应3.2聚合酶链反应是一种对特定的DNA或RNA片段在体外进行快速扩增的方法，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。[YY/T1173-2010，术语和定义3.1]3.3聚合酶链反应分析仪3.4基于聚合酶链反应（PCR）技术原理，模拟DNA或者RNA的复制过程，在模板、引物、聚合酶等存在的条件下，特异扩增已知序列，对其进行检测分析的仪器设备。[YY/T1173-2010术语和定义3.2]3.5实时荧光定量聚合酶链反应分析仪可以实现DNA或者RNA的扩增，并根据PCR过程中荧光染料释放的荧光强度的变化对扩增产物量进行定量分析的仪器设备。3.6温度偏差在温度参数校准循环程序中，实时荧光定量PCR分析仪均热块设定温度与所有采样测量孔温度平均值之差。3.7温度均匀度在温度参数校准循环程序中，实时荧光定量PCR分析仪均热块所有采样测量孔温度平均值的最大值与最小值之差。3.8温度最大过冲量在温度参数校准循环程序中，荧光定量PCR仪均热块温度升高或降低至设定值过程中，所有采样测量孔温度超出设定值的最大幅度。JJF（晋）59-202123.9平均升温速率在温度参数校准循环程序中，实时荧光定量PCR仪均热块升温过程中，所有采样测量孔单位时间上升的平均温度值。[YY/T1173-2010术语和定义3.4]3.10平均降温速率在温度参数校准循环程序中，实时荧光定量PCR仪均热块降温过程中，所有采样测量孔单位时间下降的平均温度值。[YY/T1173-2010术语和定义3.5]3.11荧光染料3.12短波长激发光激发后，能够释放出可见光的试剂。[YY/T1173-2010术语和定义3.12]3.13荧光强度精密度3.14均热块测量孔在同一荧光条件下荧光强度重复测量值的一致性。[YY/T1173-2010术语和定义3.14]3.15阈值循环数3.16均热块测量孔内的荧光信号到达指数扩增时经历的循环周期数。主要的计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为阈值循环数。[YY/T1173-2010术语和定义3.15]3.17阈值循环数精密度均热块测量孔在同一荧光条件下阈值循环数重复测量的一致性。3.13熔解温度全总DNA双螺旋结构降解一半时的温度称为熔解温度。3.14熔解曲线PCR过程中均热块测量孔的荧光强度（纵坐标）与温度（横坐标）形成的曲线。3.15熔解温度漂移实时荧光定量PCR仪校准时，根据熔解曲线计算的熔解温度值与光学模拟器熔解温度设定值之差。3.16峰值强度熔解曲线上熔解温度对应的荧光强度。3.17通道峰值强度一致性熔解曲线上，所有采样测量孔峰值强度的变化趋势。JJF（晋）59-202133.18线性灵敏系数同一熔解温度下，表征熔解曲线线性变化灵敏程度的比率。3.19熔解温度比同一熔解温度下，表征熔解温度漂移因素的比率。4概述实时荧光定量聚合酶链反应分析仪（以下简称荧光定量PCR仪）是通过实时监测随整个PCR进程而变化的荧光信号强度，同时通过标准曲线对扩增基因进行定量分析的仪器。标记有荧光染料的探针与模板基因混合后，完成高温变性、低温复性和适温延伸的热循环后，与模板基因互补配对的探针被切断，荧光染料游离于反应体系中，在特定光激发下荧光染料发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，同时利用标准曲线即可对待测扩增基因进行定量分析。荧光定量PCR仪均热块一般有32孔板、48孔板、96孔板和384孔板等几种类型，其中96孔板应用最为广泛。如图1所示，其主要由温度控制模块、微量荧光检测模块、均热块、电脑控制系统、计算机及应用软件组成。5计量特性一般情况下，荧光定量PCR仪计量性能指标如表1所示。图1荧光定量PCR仪结构示意图JJF（晋）59-20214表1荧光定量PCR仪计量性能指标6校准条件6.1环境条件环境温度：（15～30）℃；相对湿度：（20～85）%RH。其它：仪器应远离振动、电磁干扰。6.2测量标准和其它设备6.2.1光学模拟器光学模拟器集成了温度传感器和发射光发生器两部分。其温度测量范围为（0~120）℃，最大允许误差为±0.1℃，发射光发生器的波长范围为（360~780）nm，相对光辐射强度在（10%~100%）范围内可调。6.2.2标准物质校准时应采用国内外有证标准荧光染料，6.2.3移液器规格：2μl、10μl、100μl、200μl、1000μl。序号项目技术指标备注1温度偏差30℃50℃60℃70℃90℃95℃±0.5℃温度项目2温度均匀度≤1.0℃3温度最大过冲量≤3.0℃4平均升温速率50℃→90℃≥1.5℃/s温度项目5平均降温速率90℃→50℃≥1.5℃/s6阈值循环数示值误差±2.5光学系统物理项目7阈值循环数均匀度≤58阈值循环数精密度≤10%9通道峰值强度一致性±0.210线性灵敏系数±0.211熔解温度飘移±1℃12熔解温度比±0.213荧光强度精密度≤5%光学系统生物化学项目14荧光线性相关系数≥0.990JJF（晋）59-202157校准项目和校准方法7.1校准项目可根据客户要求与实际情况选择光学系统物理校准方法或光学系统生物化学校准方法其中一种对荧光定量PCR仪进行校准。选择光学系统物理方法对荧光定量PCR仪进行校准时，校准项目为温度偏差、温度均匀度、温度最大过冲量、平均升温速率、平均降温速率、阈值循环数示值误差、阈值循环数均匀度、阈值循环数精密度、通道峰值强度一致性、线性灵敏系数、熔解温度漂移、熔解温度比。选择光学系统生物化学方法对荧光定量PCR仪进行校准时，校准项目为温度偏差、温度均匀度、温度最大过冲量、平均升温速率、平均降温速率、荧光强度精密度、荧光线性相关系数。7.2校准方法7.2.1校准前的准备工作将荧光定量PCR仪及光学模拟器各部件连接完好，光学模拟器为集成传感器，下方为温度传感器，上方为荧光发射光源。在光学模拟器下方温度传感器表面上涂抹适量导热油，以确保其与均热块测量孔接触良好。如图2所示，将7个光学模拟器分布于均热块测量孔中。7.2.2校准过程按照仪器说明书设置校准程序。典型的校准程序如表2所示，将荧光定量PCR仪设定到校准温度，开启运行，设备达到稳定状态后开始记录各温度点温图27个光学模拟器位置分布示意图JJF（晋）59-20216度，记录时间间隔为0.5s，10s内共记录20组数据。温度稳定时间一般按一下原则执行：温度达到设定值，30s后开始记录温度数据，如PCR仪温度任未稳定，可按实际情况适当延长时间，温度达到设定值至开始记录数据所等待时间不超过150s。程序运行结束后，读取标准值和测量值。校准程序步骤1到步骤3为预热程序，步骤4到步骤11为温度技术指标校准程序（其中30℃的温度指标测量数据来源于步骤6；平均升、降温速率的测量数据分别来源于步骤4到步骤5和步骤5到步骤6）。步骤12、13为光学模拟器光学扩增程序，荧光定量PCR仪在步骤12和步骤13设定程序之间循环32次。表2校准设置程序步骤设定温度点持续时间备注130℃60s预热程序295℃60s330℃60s430℃60s温度技术指标校准程序595℃180s630℃120s790℃180s850℃180s970℃180s1060