GB15193x 致癌试验 征求意见稿

中华人民共和国国家标准GB15193.xx—xxxx中华人民共和国卫生部发布xxxx-xx-xx发布xxxx-xx-xx实施食品安全国家标准致癌试验（征求意见稿）GB15193.xx—xxxxI前言本标准首次发布。GB15193.xx—xxxx1食品安全国家标准致癌试验1范围本标准规定了实验动物致癌试验的基本试验方法和技术要求。本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素的致癌作用，检验对象包括食品及其原料、食品添加剂、新资源食品、辐照食品、食品相关产品（用于食品的包装材料、容器、洗涤剂、消毒剂和用于食品生产经营的工具、设备）以及食品污染物等。2术语和定义2.1致癌性实验动物长期重复给予受试物所引起的肿瘤（良性和恶性）病变发生。2.2靶器官实验动物出现由受试物引起明显毒性作用的器官。2.3最大耐受剂量是由90天经口毒性试验确定的剂量，此剂量应使动物体重减轻不超过对照组的10％，并且不产生由非肿瘤因素引起死亡及导致缩短寿命的中毒体征或病理损伤。3试验目的确定在实验动物的大部分生命期间，经口重复给予受试物引起的致癌效应，了解肿瘤发生率、靶器官、肿瘤性质、肿瘤发生时间和每只动物肿瘤发生数，为预测人群接触该受试物的致癌作用以及最终评定该受试物能否应用于食品提供依据。4仪器和试剂4.1仪器与器械实验室常用解剖器械、动物天平、电子天平、生物显微镜、生化分析仪、血细胞分析仪、血液凝固分析仪、尿液分析仪、离心机、切片机等。4.2试剂甲醛、二甲苯、乙醇、苏木素、伊红、石蜡、血球稀释液、生化试剂、血凝分析试剂、尿分析试剂等。5试验方法5.1受试物GB15193.xx—xxxx2受试物应使用原始样品，若不能使用原始样品，应按照受试物处理原则对受试物进行适当处理。将受试物掺入饲料、饮用水或灌胃给予。受试物制备或存放时，要求不影响饲料的营养成分含量和性质。5.2实验动物5.2.1动物种、系选择实验动物的选择应符合国家标准和有关规定。应选择肿瘤自发率低的动物种属和品系，可选用大鼠、小鼠，周龄6周～8周。试验开始时每个性别动物体重差异不应超过平均体重的±20%。每组动物数至少100只，雌雄各半，雌鼠应为非经产鼠、非孕鼠。若计划试验中期剖检，应增加动物数（每组至少20只，雌雄各半）。对照组动物性别和数量应与受试物组相同。5.2.2动物准备试验前动物在实验动物房至少应进行3日～5日环境适应和检疫观察。5.2.3动物饲养实验动物饲养条件、饮用水、饲料应符合国家标准和有关规定。试验期间动物自由饮水和摄食，推荐单笼饲养，亦可按组分性别分笼群饲，每笼动物数（一般大鼠不超过3只，小鼠不超过5只）应满足实验动物最低需要的空间，以不影响动物自由活动和观察动物的体征为宜。试验期间每组动物非试验因素死亡率应小于10%，濒死动物应尽可能进行血液生化指标检测、大体解剖以及病理组织学检查，每组生物标本损失率应小于10%。5.3剂量及分组5.3.1试验至少设3个受试物组，1个阴性（溶媒）对照组，对照组除不给予受试物外，其余处理均同受试物组。必要时增设未处理对照组。5.3.2高剂量应选择最大耐受剂量，原则上应使动物出现比较明显的毒性反应，但不引起过高死亡率；低剂量不引起任何毒性效应；中剂量应介于高剂量与低剂量之间，可引起轻度的毒性效应。一般剂量的组间距以2倍～4倍为宜，不超过10倍。5.4受试物给予5.4.1根据受试物的特性和试验目的，选择受试物掺入饲料、饮水或灌胃方式给予。若受试物影响动物适口性，应灌胃给予。5.4.2受试物灌胃给予，要将受试物溶解或悬浮于合适的溶媒中，首选溶媒为水，不溶于水的受试物可使用植物油（如橄榄油、玉米油等），不溶于水或油的受试物可使用羧甲基纤维素、淀粉等配成混悬液或糊状物等。受试物应新鲜配制，有资料表明其溶液或混悬液储存稳定者除外。同时应考虑使用的溶媒可能对受试物被机体吸收、分布、代谢和蓄积的影响；对受试物理化性质的影响及由此而引起的毒性特征的影响；对动物摄食量或饮水量或营养状况的影响。为保证受试物在动物体内浓度的稳定性，每日同一时段灌胃1次（每周灌胃6天），试验期间，前4周每周称体重2次，第5周～13周每周称体重1次，之后每4周称体重1次，按体重调整灌胃体积。灌胃体积一般不超过10mL/kgBW，如为水溶液时，最大灌胃体积可达20mL/kgBW；如为油性液体，灌胃体积应不超过4mL/kgBW。各组灌胃体积一致。5.4.3受试物掺入饲料或饮水给予，要将受试物与饲料（或饮水）充分混匀并保证该受试物配制的稳定性和均一性，以不影响动物摄食、营养平衡和饮水量为原则。饲料中加入受试物的量很少时，宜先将受试物加入少量饲料中充分混匀后，再加入一定量饲料后再混匀，如此反复3次～4次。受试物掺入饲料比例一般小于质量分数5%，若超过5%时（最大不应超过10%），可调整对照组饲料营养素水平（若受试物无热量或营养成分，且添加比例大于5％时，对照组饲料应填充甲基纤维素等，掺入量等同高剂量），使其与受试物各剂量组饲料营养素水平保持一致，同时增设未处理对照组；亦可视受试物热量或营养成份的状况调整剂量组饲料营养素水平，使其与对照组饲料营养素水平保持一致。受试物剂量单位是每公斤体重所摄入受试物的毫克（或克）数，即mg/kgBW（或g/kgBW），当受试GB15193.xx—xxxx3物掺入饲料其剂量单位亦可表示为mg/kg（或g/kg)饲料，掺入饮水则表示为mg/mL水。受试物掺入饲料时，需将受试物剂量（mg/kgBW）按动物每100克体重的摄食量折算为受试物饲料浓度（mg/kg饲料）。5.5试验期限5.5.1试验期限小鼠为18个月，大鼠为24个月，个别生命期较长和自发性肿瘤率较低的动物可适当延长。5.5.2试验期间，当最低剂量组或对照组存活的动物数仅为开始时的25%时（雌、雄性动物分别计算），可及时终止试验。高剂量组动物因明显的受试物毒性作用出现早期死亡，不应终止试验。5.6试验步骤和观察指标5.6.1一般观察5.6.1.1试验期间至少每天观察一次动物的一般临床表现，并记录动物出现中毒的体征、程度和持续时间及死亡情况。5.6.1.2应特别注意肿瘤的发生，记录肿瘤发生时间、发生部位、大小、形状和发展等情况。5.6.1.3对濒死和死亡动物应及时解剖并尽量准确记录死亡时间。5.6.2体重、摄食量及饮水量试验期间前13周每周记录动物体重、摄食量或饮水量（当受试物经饮水给予时），之后每4周一次。试验结束时，计算动物体重增长量、总摄食量、食物利用率（前三个月）、受试物总摄入量。5.6.3眼部检查试验前，对动物进行眼部检查（角膜、球结膜、虹膜）。试验结束时，对高剂量组和对照组动物进行眼部检查，若发现高剂量组动物有眼部变化，则应对其他组动物进行检查。5.6.4血液学检查5.6.4.1试验第3、6、12个月进行血液学检查，必要时，试验第18个月和试验结束时也可进行，每组至少检查雌雄各10只动物，每次检查应尽可能使用同一动物。如果90天经口毒性试验的剂量水平相当且未见任何血液学指标改变，则试验第3个月可不检查。5.6.4.2检查指标为白细胞计数及分类（至少三分类）、红细胞计数、血小板计数、血红蛋白浓度、红细胞压积、红细胞平均容积（MCV）、红细胞平均血红蛋白量（MCH）、红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）、凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）等。如果对造血系统有影响，应加测网织红细胞计数和骨髓涂片细胞学检查。5.6.5血生化检查5.6.5.1按5.6.4.1规定的时间和动物数进行。如果90天经口毒性试验的剂量水平相当且未见任何血生化指标改变，则试验第3个月可不检查。采血前宜将动物禁食过夜。5.6.5.2检查指标包括电解质平衡、糖、脂和蛋白质代谢、肝（细胞、胆管）肾功能等方面。至少包含谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）、谷氨酰转肽酶（GGT）、尿素（Urea）、肌酐（Cr）、血糖（Glu）、总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、钙、氯、钾、钠、总胆红素等，必要时可检测磷、尿酸（UA）、总胆汁酸（TBA）、球蛋白、胆碱酯酶、山梨醇脱氢酶、高铁血红蛋白、激素等指标。5.6.6尿液检查5.6.6.1试验前、试验第3、6、12个月进行尿液检查，必要时，试验第18个月及试验结束时也可进行，每组至少检查雌雄各10只动物。如果90天经口毒性试验的剂量水平相当且未见任何尿液检查结果异常，则试验第3个月可不检查。5.6.6.2检查项目包括外观、尿蛋白、比重、pH、葡萄糖和潜血等，若预期有毒反应指征，应增加尿液检查的有关项目如尿沉渣镜检、细胞分析等。5.6.7病理检查GB15193.xx—xxxx45.6.7.1大体解剖所有试验动物，包括试验过程中死亡或濒死而处死的动物及试验期满处死的动物都应进行解剖和全面系统的肉眼观察，包括体表、颅、胸、腹腔及其脏器，并称量脑、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、子宫、卵巢、睾丸、附睾、胸腺、肾上腺的绝对重量，计算相对重量（脏/体比值和脏/脑比值），必要时还应选择其他脏器，如甲状腺/甲状旁腺等。5.6.7.2组织病理学检查5.6.7.2.1组织病理学检查的原则（重点检查肿瘤和癌前病变）：a)可以先对高剂量组和对照组动物所有固定保存的器官和组织进行组织病理学检查；b)发现高剂量组病变后再对较低剂量组相应器官和组织进行组织病理学检查；c)试验过程中死亡或濒死而处死的动物，应对全部保存的组织和器官进行组织病理学检查；d)对大体解剖检查肉眼可见的病变器官和组织进行组织病理学检查；e)成对的器官，如肾、肾上腺等，两侧器官均应进行组织病理学检查。5.6.7.2.2应固定保存以供组织病理学检查的器官和组织包括唾液腺、食管、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、肝脏、胰腺、脑（包括大脑、小脑和脑干）、垂体、坐骨神经、脊髓（颈、胸和腰段）、肾上腺、甲状旁腺、甲状腺、胸腺、气管、肺、主动脉、心脏、骨髓、淋巴结、脾脏、肾脏、膀胱、前列腺、睾丸、附睾、子宫、卵巢、乳腺等。必要时可加测精囊腺和凝固腺、副泪腺、任氏腺、鼻甲、子宫颈、输卵管、阴道、骨、肌肉、皮肤和眼球等组织器官。应有组织病理学检查报告，病变组织给出病理组织学照片。6数据处理和结果评价6.1数据处理6.1.1应将所有的数据和结果以表格形式进行总结，列出各组试验开始前的动物数、试验期间动物死亡数及死亡时间、出现肿瘤及其他毒性反应的动物数，重点描述肿瘤发生部位、数量、性质、癌前病变及肿瘤潜伏期。6.1.2肿瘤发生率是整个试验结束时患肿瘤动物数在有效动物总数中所占的百分率。有效动物总数指最早发现肿瘤时存活动物总数。肿瘤发生率（%）=（试验结束时患肿瘤动物数/有效动物总数）×100%6.1.3肿瘤潜伏期即从摄入受试物起到发现肿瘤的时间，因为内脏肿瘤不易觉察，通常将肿瘤引起该动物死亡的时间定为发生肿瘤的时间。6.1.4对动物体重、摄食量、饮水量（受试物经饮水给予）、食物利用率、血液学指标、血生化指标、尿液检查指标、脏器重量、脏/体比和脏/脑比、大体和组织病理学检查、患肿瘤的动物数、每只动物肿瘤发生数、各种肿瘤（良性和恶性）的数量、肿瘤发生率及肿瘤潜伏期等结果进行统计学分析。一般情况，计量资料采用方差分析，进行受试物各剂量组与对照组之间均数比较，分类资料采用Fisher精确分布检验、卡方检验、秩和检验，等级资料采用Ridit分析、秩和检验等。6.2结果评价6.2.1致癌试验阴性结果确立的前提是小鼠在试验期为15个月或大鼠为18个月时，各组动物存活率不小于50％；小鼠在试验期为18个月或大鼠为24个月时，各组动物存活率不小于25％。6.2.2致癌试验阳性结果的判断采用世界卫生组织（WHO，1969）提出的标准，符合以下任何一条，可判定受试物为对大鼠的致癌物：a)肿瘤只发生在试验组动物，对照组中无肿瘤发生；b)试验组与对照组动物均发生肿瘤，但试验组发生率高；c)试验组动物中多发性肿瘤明显，对照组中无多发性肿瘤，或只是少数动物有多发