化学合成多肽药物药学研究技术指导原则（试行）

202302一、前言...................................................................................1二、原料药制备工艺...............................................................1（一）合成工艺的选择.........................................................1（二）物料及控制................................................................2（三）生产工艺....................................................................41、工艺描述.......................................................................42、反应终点控制................................................................43、中间体控制....................................................................4三、结构确证...........................................................................5四、制剂处方工艺...................................................................6（一）剂型的选择................................................................6（二）处方筛选及工艺开发.................................................7（三）工艺描述及中间体控制.............................................8五、质量研究与控制...............................................................9（一）原料药的质量研究.....................................................91、鉴别.............................................................................102、氨基酸比值..................................................................103、杂质.............................................................................104、含量测定....................................................................13（二）制剂的质量研究.......................................................13六、稳定性研究.....................................................................14七、参考文献.........................................................................151/15一、前言多肽是由多个氨基酸通过酰胺键相连形成的化合物，可通过基因重组表达、生物提取、化学合成等方法制备。化学合成多肽药物在制备方法、结构确证、质量研究等方面均存在自身特性，不能简单的将其归属于小分子化学药物或生物制品。同时，许多国内外指导性文件均明确不涵盖多肽类药物。本指导原则在2007年版《合成多肽药物药学研究技术指导原则》的基础上，对合成多肽药物药学研究方面所涉及的特殊问题进行分析，结合国内外对多肽药物研究和评价的实践经验，提出化学合成多肽药物药学研究的一般性技术要求，供业界参考执行。本指导原则的起草是基于对多肽药物的当前认知，随着多肽药物研究技术的提高和相关法规的完善，本指导原则将不断修订。本指导原则仅适用于采用化学合成法制备的多肽药物。二、原料药制备工艺（一）合成工艺的选择根据反应载体不同，多肽原料药的合成工艺主要包括液相合成法和固相合成法。根据肽键形成的顺序，多肽原料药的合成工艺主要包括线性合成法和片段缩合合成法。在合成2/15工艺选择时应结合目标肽链的长短和氨基酸特性综合考虑。需要注意的是，在多肽合成过程中会产生一些与目标肽链结构类似的杂质，如缺失肽、插入肽、错结肽和差向肽等，诸如此类杂质的产生和蓄积会增加多肽成品提纯的难度，合成工艺选择时应避免或减少此类肽相关杂质的产生。以固相合成工艺为例，在工艺开发时应关注氨基酸保护/脱保护策略、缩合剂选择依据、树脂选择依据、氨基酸偶联、裂解、纯化、肽链修饰和富集冻干等研究内容。对于多肽纯化方法的选择，需要综合考虑肽链长短、极性和荷电性以及粗品纯度等因素，对纯化前后样品进行质量对比研究，证明拟采用的纯化方式可有效起到提纯效果。在开发冻干工艺时需充分考虑冻干条件的合理性，提供详细的冻干工艺参数，并对冻干前后样品进行质量对比研究。过滤等工艺中若存在极端pH值或有机溶剂条件，还需考虑进行必要的滤膜相容性研究。（二）物料及控制根据ICHQ11及其问答文件等相关要求，在多肽原料药的合成工艺中，保护氨基酸或肽段的质量状况直接影响多肽药物质量，应定义为起始物料。保护氨基酸的质量控制项目一般应包括性状、有关物质、手性异构体、残留溶剂、含量测定等。由于保护氨基酸中的杂质可能伴随化学反应而发生杂质传递和转化，继而增加多3/15肽药物的提纯难度，应增加必要的杂质研究，同时制定合理的控制限度。应结合保护氨基酸的合成工艺确定杂质谱组成，以Fmoc保护氨基酸为例，常见的杂质包括保护不完全氨基酸、手性异构体、同分异构体、二肽衍生物、β-丙氨酸杂质等（如表1）。应开发出能有效检出各潜在杂质的分析方法，并对分析方法进行必要的方法学验证，充分证明所采用方法的可行性。保护氨基酸合成过程中如果使用了某些溶剂，如乙酸乙酯、乙酸等，需要对其残留进行合理控制，以避免在后续偶联反应中出现“封端”现象。表1Fmoc保护氨基酸中常见的杂质杂质描述保护不完全氨基酸游离氨基酸（未保护）或部分保护的氨基酸手性异构体含有手性中心的氨基酸可能存在，如D-氨基酸中存在L-氨基酸二肽衍生物如Fmoc-Leu-OH中存在Fmoc-Leu-Leu-OHβ-丙氨酸（Ala）杂质在使用9-芴甲基N-琥珀酰亚胺碳酸酯（Fmoc-OSu）时，可能产生Fmoc-β-Ala-OH和Fmoc-β-Ala-AA-OH同分异构体如亮氨酸（Leu）中存在异亮氨酸（Ile）片段缩合合成法中，采用肽段作为起始物料，应提供肽段的合成工艺及必要的结构确证资料，应结合多肽终产品质量标准制定肽段的质控项目，如鉴别、纯度和含量测定等。肽段有关物质考察应重点关注可能引入到终产品中的其他短肽残留情况，建立相应的杂质控制策略，并提供必要的方法学验证资料。同时，也应该提供研究资料明确肽段的储存条件和时限。4/15固相合成中，树脂作为必需物料，其质量可直接影响多肽药物质量，应提供树脂的来源、质量标准和检验报告，并对树脂的摩尔取代系数、所用合成条件下的膨胀系数和稳定性情况等予以说明。由于缺乏有效的表征手段和针对性的质控方法，不推荐与肽链C端氨基酸相连的树脂作为起始物料。（三）生产工艺1、工艺描述应提供详细的工艺描述，以代表性批次，如注册批、工艺验证批为例，按照工艺流程详细描述各步工艺操作，包括反应试剂、投料量、反应条件、过程控制等。如果纯化方法使用制备型液相色谱仪，应提供载样量、洗脱程序、收集范围以及各洗脱液的处理方式等。2、反应终点控制液相合成反应终点一般可采用色谱法（如TLC法、HPLC法）监测；固相合成反应的终点可采用茚三酮法、三硝基苯磺酸法和四氯苯醌法等监测；二硫键连接的反应终点可采用Ellman试验或HPLC法监测。除上述方法外，其他合适的方法也可以使用。监测方法应确保方法灵敏度符合检测要求。需要注意的是，有些情况下单独一种监测方法的检测灵敏度可能不够，可采用多种手段进行监测。3、中间体控制对于液相合成，应参照《化学药物原料药制备和结构确5/15证研究的技术指导原则》对中间体的质量进行控制，特别要对缩合片段制订合理的质量控制措施（例如分子量、有关物质和含量等）。对于固相合成，在氨基酸偶联过程中，因肽链未与树脂裂解，缺少有效的中控手段，对肽链从树脂切割后的中间体应建立合理的控制措施。在综合分析后续纯化和冻干等步骤杂质谱变化情况的基础上，制定合理的中间体质控限度。三、结构确证多肽分子由多种氨基酸组成，通常分子量较大，通过小分子化学药物结构研究常用的一些方法（例如紫外光谱、红外光谱、核磁共振波谱等）来解析多肽的结构存在一定的困难。可采用适当的方法确证多肽药物一级结构（即氨基酸序列及其修饰情况），并酌情采用其他方法确证其高级结构。多肽原料药的一级结构确证中，应明确各氨基酸的连接顺序。对于具有氨基酸侧链修饰的多肽以及存在两个以上分子内环（如二硫键、酰胺键等）的环肽，应明确具体修饰位点、修饰物结构以及每个内环键的具体连接位点。氨基酸序列分析可采用多级质谱联用（MS-MS）、Edman降解等方法。多肽药物的高级结构一般包括二级结构（如螺旋、折叠、转角等）和三级结构，且与肽链所处的溶液环境密切相关。可先通过文献资料等论述说明是否存在高级结构，如存在，应结合药物制剂进行综合考察。对于具有一定高级结构才能6/15发挥其生物活性或缓释作用的多肽创新药物，应分析其高级结构对体内生物活性的影响。对于多肽仿制制剂，应具有与参比制剂一致的高级结构。具体的研究方法例如：圆二色谱（CD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、拉曼光谱、核磁共振波谱（NMR）、晶体X-射线衍射（XRD）、分析超速离心（AUC）、场流分离（FFF）、荧光光谱等。同时，可结合多肽药物的体内/体外生物活性研究结果，佐证其高级结构。四、制剂处方工艺化学合成多肽药物制剂研究应遵循小分子化学药物的一般规律，可参照《化学药物制剂研究基本技术指导原则》、《化学药品注射剂仿制药质量和疗效一致性评价技术要求》等开展相应研究。同时，需关注多肽药物的特殊性，如理化性质和稳定性等。（一）剂型的选择与小分子化学药物相比，多肽药物多具有稳定性差、易酶解、脂溶性差等特点，化学合成多肽药物通常选择注射途径给药。近年来，随着多肽药物研发的深入和制剂技术的进步，多肽药物剂型选择的范围逐步扩大，鼓励根据临床使用需要，开发临床需求广泛、顺应性好的剂型，如长效制剂、口服制剂、吸入制剂等。7/15（二）处方筛选及工艺开发在进行多肽药物的制剂研究时，需要充分了解原料药的理化性质，如溶解度、pH值、pI、比旋度、高级结构、水分、油/水分配系数等，应关注原料药在不同pH值、离子强度、光、热、湿、氧化等条件下的稳定性情况。结合拟开发药物的关键质量属性，有针对性地进行研究。在整个处方工艺开发过程中需关注多肽药物的化学和物理稳定性。处方筛选时，可根据原料药性质和剂型特点进行辅料选择，应有利于提高多肽药物的稳定性，避免辅料与原料药的不良相互作用，同时应尽量减少不必要辅料的使用。关注辅料是否会引起多肽药物的杂质谱和/或高级结构发生变化，从而影响药物的安全性。例如，某些辅料中的醛基可能与肽链中的氨基发生反应；某些辅料可能引起体系的pH值、离子强度等发生