2免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计

HRP标记单抗建立Elisa夹心法测定相应抗原含量汇报人：闫斯楠时间：13.7.6一、CEA介绍大肠癌组织可产生一种糖蛋白，作为抗原引起患者的免疫反应。此种抗原称为癌胚抗原（carcino-embryonicantigenCEA），可广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌，也存在于正常胚胎的消化管组织中，在正常人血清中也可有微量存在。癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计是一个较好的肿瘤标志物。二、方案设计常规夹心法CEA抗体1-抗原-CEA抗体2-二抗（HRP标记）本实验夹心法CEA抗体1-抗原-CEA抗体2（HRP标记）该方案是直接法与夹心法的有效结合，兼具两者的优点。为目前市面上Elisa检测试剂盒的通用发法。三、主要技术方法双抗夹心法ElisaHRP标记CEA单抗2SephadexG-25层析法1.ElisaA.实验步骤：1.抗原预包被。用包被缓冲液将抗原稀释（浓度由预实验确定），每孔加入200微升，37℃孵育1小时后，4℃放置16-18小时。2.洗涤。倒尽板孔中液体，加满洗涤缓冲液，静止3分钟后倒掉。反复3次，最后一次尽量拍干板孔中剩余液体。3.加封闭缓冲液每孔200微升，37℃放置1小时。4.同2步洗涤。5.加被测血清100微升（做梯度稀释），并作阳性、阴性及空白对照。37℃放置1小时或者4℃过夜。6.同2步洗涤。7.加二抗。50微升每孔加入适宜浓度的二抗，37摄氏度放置1小时。8.同2步一样洗涤，并多重复一次，最后一次重复后一定要排干所有水分，否则会有假阳性出现。9.显色。每孔加入底物溶液100微升，室温暗处放置10-15分钟，然后用终止液终止显色。10.酶标仪读数。B.需要配制的试剂1.包被缓冲液：0.05MpH9.6碳酸缓冲液，4℃保存Na2CO30.15gNaHCO30.293g稀释至100ml2.洗涤缓冲液：0.01MpH7.4PBS-Tween-20，室温保存NaCl8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4·12H2O2.9g或者Na2HPO41.15gTween-200.5ml(用前临时加入)稀释至1000ml3.封闭缓冲液：在洗涤缓冲液中加入5%脱脂奶粉或者10%BSA或者0.5%鸡卵清蛋白。（用时现配）4.稀释缓冲液：在洗涤缓冲液中加入0.1%BSA。（用时现配）5.显色终止液：2MH2SO4，室温保存蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7ml，并边加入边混匀。6.底物缓冲液：pH5.0磷酸棗柠檬酸，4℃保存Na2HPO47.298g柠檬酸4.669g加水至1000ml7.底物溶液：TMBS底物使用液（用时现配），450nm显色TMBS（1mg/ml无水乙醇）1.0ml底物缓冲液10ml1%H2O225微升2.HRP标记CEA单抗2戊二醛二步法和过碘酸钠法Ⅰ.戊二醛二步法A.原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。B.标记步骤：(1)称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。(2)反应后的酶溶液经SephadexG-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。(4)用1MPH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中。(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。C.需要配制的试剂：(1)0.1MPH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2MNa2HPO449ml,0.2MNaH2PO451ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。(2)1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。(3)1MPH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。(4)0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01MPH9.5碳酸缓冲液1ml中。(5)0.15MPH7.4PBS及生理盐水。(6)PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。(7)萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。(8)纯化的特异性抗体或抗Ig抗体（购买）。(9)HRP(RZ3.0)（购买）。D.优缺点本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4％的酶与蛋白质结合。Ⅱ.过碘酸钠法A.原理：HRP经NaIO４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏碱，后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。B.标记步骤:(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mMPH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。(4)加20μl0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mgIgG(抗体，或SPA5mg)在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。(5)加0.1ml新配的4mg／mlNaBH４液，混匀，再置4℃2小时。(6)将上述液装入透析袋中，对0.15MPH7.4PBS透析，4℃过夜。(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中。(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。C.需要配制的试剂(1)0.1MNaIO４：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂)溶于蒸馏水10ml中。(2)1mMPH4.4醋酸钠缓冲液:0.2MNaAc(1.361克／50ml)3.7ml0.2MHAc(0.601ml／50ml)6.3ml加蒸馏水至2,000ml。(3)0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液:Na２CO３0.32克NaHCO３0.586克加蒸馏水至50ml再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01MPH9.5的碳酸盐缓冲液。(4)NaBH４溶液(4mg／ml):临用时称取NaBH４4mg溶于1ml蒸馏水中。(5)其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。D.优缺点本法所获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。3.SephadexG-25层析A.分离原理：当混合样液加到凝胶柱上，随着洗脱剂而通过凝胶柱时，分子大小不同的物质受到不同的阻滞作用。颗粒接近或大于网眼的分子，不能进入凝胶的网眼中，在重力作用下它们随着溶剂在凝胶颗粒之间沿较短流程向下流动，受到的阻滞作用小，移动速度快，先出层析柱（此现象叫作被排阻。被排阻的最小分子量称为该规格凝胶的排阻极限）；而颗粒小于网眼的分子可渗入凝胶网眼之中，它们被洗脱时不断地从一个网眼穿到另一个网眼，逐层扩散，阻滞作用大，流程长，移动速度慢，因而后出层析柱。在层析柱的出口处，我们用多个试管分步收集洗脱液，就可将混合物中各组分彼此分离。当我们从生物组织中用盐析法提取蛋白质后，常需要进行蛋白质的脱盐工作，我们可采用层析介质为葡聚糖凝胶G-25，用适当的洗脱剂进行洗脱，经凝胶层析，就可以将大分子蛋白质与小分子盐类分离。B.试剂的配制1.葡聚糖凝胶Ｇ-25溶胀凝胶方法：按每个层析柱约4g的量称取葡聚糖凝胶G-25于烧杯中，加过量蒸馏水于沸水浴中溶胀2小时或在室温下溶胀6小时以上。用倾泻法除去上层漂浮的细碎凝胶，重复3～4次。操作中避免剧烈搅拌，防止破坏其交联结构。2.BaCl2溶液（1%）3.考马斯亮蓝G-250称取0.1g考马斯亮蓝G-250，先溶于50mL95%乙醇中，再加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。暗处存放。4.脲（6mol/L）5.洗脱剂常规PBSC.操作步骤1.层析柱的准备(1)清洗：每组取一支层析柱，用清水冲洗干净。（若玻璃柱较脏，应卸去塑料装置，先入洗液中浸泡2小时。）(2)安装与检查：检查出口装置中尼龙绸或烧结滤板是否完好干净。安装层析柱，让其垂直固定于滴定台架上。对准出口处，放一只250mL烧杯。向层析柱内灌洗脱剂，打开出口螺旋夹，检查有无渗漏、出口乳胶管是否通畅等情况。(3)排气泡：保持柱内一定的水位，用手指弹击柱壁，部分气泡会从溶液中上浮排出。出口处的小气泡易停留在螺旋夹附近的乳胶管内，要想法排尽，否则会影响分离结果，排气完毕，保留柱内1～2cm高水位，关紧螺旋夹。(4)标记高度：在距顶端8～10cm处做一标记，作为衡量灌装层析介质床体高度（15～17cm）的依据。2.装柱每组用50mL烧杯取溶胀的凝胶悬浆25～30mL，静置片刻，观察凝胶沉淀与水的体积之比，约为1:1即可，否则应作调整。轻轻搅匀杯中凝胶，用玻璃棒引流入柱，打开出水口，并不断地向柱内补充凝胶，直到凝胶沉淀高度位于标记上方约2cm为止，凝胶柱内若有气泡和断层或柱床表面干水和歪斜，都将影响分离效果。必要时，需倒出凝胶，重新装柱。3.平衡取15mL洗脱剂，用滴管沿柱内壁旋转着缓缓流下，不可冲动胶平面，打开出水口，经洗脱液的流动，一方面清洗内壁，另一方面使胶床收紧。洗脱平衡完毕，胶床上方保留约4cm高水位，关闭出水口。此时，胶床高度≥15cm为宜。4.准备收集取6只干净的刻度试管（除净试管内残留的水），1～6编号，并在试管2mL处作一标记，插入试管架上，为收集洗脱样品作好准备。5.上样与收集打开出口排水，当胶床与上方水层的弯月面相切时，关闭出口，用滴管将0.2mL混合样液沿柱内壁缓缓加入，勿冲动胶面。上样完毕，打开出水口，开始收集一号管。每管收集洗脱液2mL。当样液进入胶床，其弯月面与胶平面相切时，暂停排液，用滴管将洗脱剂沿柱内壁旋转着加入1cm高水位，然后排液，至其弯月面与胶平面相切，再缓缓注入3～5cm高的洗脱剂。6.洗脱不断向柱内加洗脱剂，保持胶床上水位3～5cm。出口流速控制在每6秒1滴，直至收集到6号管达2mL时，关闭出口。7.鉴定另取6只干净试管，按收集顺序将洗脱液一分为二，即每管1mL，依次在试管架上排成二排。第一排每管加2滴BaCl2，根据白色沉淀多少，判断SO42-在各管中的浓度。第二排每管加1mL考马斯亮蓝G-250试剂，根据蓝色情况，判断蛋白质在各管中的浓度。将结果记录于下表中。若鉴定的第6号管中，仍有样品，表明洗脱和收集不够，需增加7号、8号……试管继续洗脱与收集，同上法鉴定其蛋白质和盐浓度情况。管号项目1234567891011白色沉淀量蓝色深浅8.再生鉴定完毕，打开出水口，继续用２～３倍床体积洗脱剂洗脱，洗脱后关闭出口，以备下次使用。四、实验所需购买材料、试剂材料、试剂订购公司价格预计使用量赖氨酸金泰公司（长春）124元/100g100gHRP（辣根过氧化物酶）金泰公司（长春）250元/100mg20mgCEA抗原（L1C00207）上海领潮科技有限公司待询（1mg/mL）1mgCEAIgG1（单抗货号L1C00205）上海领潮科技有限公司待询1mgCEAIgG1（多抗货号L1C00202）上海领潮科技有限公司待询5mgNaIO４金泰公司（长春）80元/100g500mgNaBH４金泰公司（长春）90元/100g500mgSephadexG-25层析柱(2cm×50cm/1cm×25