实验三酶联免疫吸附试验（ELISA)

实验五1.酶联免疫吸附试验（ELISA)2.补体结合反应1.酶联免疫吸附试验（ELISA)免疫标记技术1.定义：将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。2.分类：放射免疫测定法：131I，32P免疫荧光技术：FITC，PE免疫酶测定法：HRP，AP免疫酶测定法(EnzymeImmunoAssay,EIA)•用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。–辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)•特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值•分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。1.定义2.分类间接法（IndirectELISA）：•将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗•检测液相中未知抗体双抗体夹心法（SandwichELISA)：•将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗•检测液相中的可溶性抗原竞争法（CompetitiveELISA)：•将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体•检测液相中的可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)3.原理（以间接性ELISA为例）：显色实验内容：间接法测定溶血素——定性检测实验材料脱纤维绵羊红细胞——抗原兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素）——待测兔血清HRP标记羊抗兔IgG——二抗包被缓冲液：0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液洗涤液：含0.05%Tween20的0.01MpH7.4PBS底物缓冲液：pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：OPD10mg，底物缓冲液25ml，30%H2O240μL酶标板，酶标仪实验方法1.抗原的处理：脱纤维绵羊血加3mLN.S，混匀2000rpm，5min加3mLN.S，混匀2000rpm，5min取2mL压积红细胞加入2mL蒸馏水，震荡破碎红细胞用包被缓冲液稀释成1：400备用2.包被抗原：取酶标板，加入100μL/孔的抗原稀释液4℃，湿盒内，18h取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次3.加待测血清标记各孔，加入相应液体100μL/孔1234阴性空白阳性待测4.加二抗：37℃，湿盒内，30min甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次各孔加入酶标二抗100μL/孔37℃，湿盒内，30min5.显色：甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次加入底物溶液100μL/孔避光显色，10min6.观察结果实验方法预期结果•阳性：显色为黄色•阴性：无色1234阴性阴性阳性阳性注意事项•洗涤彻底，避免交叉污染。•按顺序加样，孔底无气泡。•包被和温育在湿盒内进行。2.补体结合反应（ComplementfixationTest,CFT）概念：补体结合反应：是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应。补反中包括两个系统五种成分：待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。指示系统：绵羊红细胞和溶血素。原理：待测系统抗原+未知血清12补体12Step1抗原抗体复合物的形成Step2补体的结合和耗竭指示系统SRBC+抗SRBC抗体Step3SRBC的裂解121：NoAb；2：AbAg待测血清Ab阳性NoAb阴性AgAgAg抗原：伤寒菌裂解产物待测血清：56℃，30min补体：豚鼠血清2%绵羊红细胞溶血素材料：方法：12345试验管血清对照管抗原对照管补体对照管SRBC对照管待测血清0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.4mL0.8mL抗原补体N.S摇匀，37℃，水浴15min溶血素SRBC0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL………………………………………………摇匀，37℃，水浴15min（1份/2人）预期结果：1．管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。溶血不溶血2.试验管血清对照管抗原对照管补体对照管SRBC对照管？溶血溶血溶血不溶血•绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。•各种试剂的吸管不可混用。注意事项：