MC-1型ELISA试剂盒说明书[PDF]-使用说明书

微囊藻毒素-LR酶联免疫检测试剂盒(MC-I型)使用说明书User’sBrochureofELISAKit(MC-I)forMicrocystin-LRDetection北京金达清创环境科技有限公司版权所有北京金达清创环境科技有限公司说明书目录一、试剂盒简介....................................1二、试剂盒组成....................................2三、所需仪器和设备.............................3四、操作流程........................................4五、样品处理........................................5六、实验准备........................................6七、实验步骤........................................6八、结果分析........................................9九、注意事项......................................11十、服务及购买信息...........................13附录一、水样的浓缩...........................14附录二、固体样品的处理....................15北京金达清创环境科技有限公司一、本试剂盒简介本试剂盒系采用自行研制的微囊藻毒素-LR(MC-LR)与BSA的偶联物作为包被抗原，采用自制的抗MC-LR单克隆抗体(MC8C10)作为一抗，组成的MC-LR间接竞争ELISA检测试剂盒。该试剂盒可用于水中微囊藻毒素-LR的定量检测；其它固体样品(如藻类、底泥、动物组织等)经过提取后，也可采用该试剂盒进行定量检测。该试剂盒特异性好，与第四位非精氨酸的微囊藻毒素几乎没有交叉反应；与第四位为精氨酸的微囊藻毒素有较小的交叉反应(≤10%)。敏感性高：最低检测限0.1μg/L；定量检测区间0.2~4.0μg/L。稳定性强：变异系数≤10%。检测时间：~2h适应环境温度：20~40oC-1-北京金达清创环境科技有限公司二、试剂盒组成1)使用说明书1份2)96孔酶标板板1块(8孔/条×12条)(包被有MC-LR-BSA)3)MC-LR标准品5瓶(2mL/瓶)(0.2μg/L,0.5μg/L,1.0μg/L,2.0μg/L,4.0μg/L)4)微囊藻毒素-LR抗体1瓶(7mL)5)酶标二抗溶液1瓶(12mL)6)显色底物液A1瓶(6mL)7)显色底物液B1瓶(6mL)8)终止液1瓶(7mL)9)浓缩洗涤液(20×)1瓶(18mL)-2-北京金达清创环境科技有限公司三、所需仪器和设备1)单道微量移液器(20~200μL)1支可选配多道微量移液器(20~200μL)1支2)酶标仪(含450nm波长)，自带打印功能，或配置打印机，或配置电脑3)0.45μm微滤膜过滤装置，或高速离心机4)4oC冷藏冰箱5)计时器；烧杯等-3-北京金达清创环境科技有限公司四、操作流程四、操作流程-4-试剂准备试剂准备样品处理加入样品/标准品和抗体加入酶标二抗室温，50min加入显色底物室温，40min室温，10min吸光度测定结果分析北京金达清创环境科技有限公司五、样品处理对于较干净的水样(如饮用水)可直接测定。对于浊度较高的水样，预处理如下：取5mL水样，使用0.45µm超滤膜过滤(或10000rpm离心20min)。若样品中MC-LR含量可能较高(4.0μg/L)，可用超纯水对样品进行适当稀释再测定。若样平中MC-LR含量可能较低(0.2μg/L)，若有必要，则可对样品进行适当浓缩再测定，具体方法见附录一。对于固体样品(如藻类、底泥、动物组织样品)，则需要将其中的MC-LR进行提取才能测定，具体方法见附录二。-5-北京金达清创环境科技有限公司六、实验准备1)将试剂盒从冰箱取出，放置室温下，平衡10min。2)将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍(例如：0.8mL浓缩洗涤液+15.2mL蒸馏水，足够2条(16孔)酶标板洗涤3次)。七、实验步骤1)酶标板布局与编号：例如取下1、2两条(即设置2个平行)，设置空白孔(不含一抗)、阴性孔(不含MC-LR)、微囊藻毒素标准品孔、样品孔，并记录对应位置。如下图所示。注意：每一次测定样品时必须同步测定空白、阴性以及标准曲线。若以上内容每个设置2个平行，则每块96孔板一次最多可测定41个样品。-6-北京金达清创环境科技有限公司12ABB空白(Blank)BNN阴性(Negative)CC1C1DC2C2EC3C3FC4C4GC5C5标准品(Calibration)HS1S1样品(Sample)2)加入标准品/样品和抗体空白孔(B)各加入100µL超纯水；阴性孔(N)各加入50µL超纯水；标准品孔(C1~C5)分别加入50µLMC-LR标准品：0.2μg/L,0.5μg/L,1.0μg/L,2.0μg/L,4.0μg/L；样品孔(S)各加入50µL待测样品。除空白孔外，其它孔各加入50µLMC-LR抗体。-7-北京金达清创环境科技有限公司3)反应：轻轻振摇混匀。室温下孵育50分钟。4)洗涤：甩掉板中液体，每孔加入约300µL洗涤液，放置30s后用力甩掉洗液，再重复洗涤2次。5)每孔加入100µL酶标二抗溶液，室温下孵育40分钟。6)洗涤：甩掉板中液体，每孔加入约300µL洗涤液，放置30s后，用力甩掉洗液，再重复洗涤3~4次。7)每孔加入50µL底物A后，再同时加入50µL底物B溶液，轻轻振摇混匀，室温下显色10分钟。8)在每个微孔中加入50µL终止液，终止显色反应，此时蓝色孔将迅速变为黄色孔。9)轻轻摇动微孔板，10分钟内在450nm处测定各孔的吸光度(A值)。-8-北京金达清创环境科技有限公司八、结果分析实验有效性分析实验结果须满足以下有效性参数：空白孔吸光度≤0.08；阴性孔吸光度≥0.80；标准品(0.2~4.0μg/L)线性度R2≥0.97；平行孔CV%≤10%。计算上述实验步骤为例，以测定的微囊藻毒素标准品(C1~C5)吸光度(A)平均值为纵坐标，以各标准品浓度的对数(lgC)为横坐标，绘制标准曲线(在对数坐标系中应为直线)，应用Excel即可对该直线进行拟合，得出方程A=a×lgC+b中a，b的值以及R2值。如下表所示。按照上述拟合的直线方程，计算出各样品孔吸-9-北京金达清创环境科技有限公司光度(A)对应的样品浓度对数值lgC；进一步求反对数，即可得样品提取液中的微囊藻毒素浓度。如下表所示，样品1的浓度CS1=0.49μg/L。12均值CV%拟合及计算A0.0120.0140.0130.1B1.1751.1491.1621.8C1.1111.0421.0774.9D0.8450.8840.8652.8E0.7170.6920.7051.8F0.5160.5390.5281.6G0.3530.3860.3702.3A=-0.546lgC+0.698R2=0.9997H0.8560.8770.8671.5CS1=0.49μg/L注意1)若样品吸光度高于标准品0.2μg/L的吸光度，并且接近阴性孔的吸光度，则样品中MC-LR的-10-北京金达清创环境科技有限公司浓度0.2μg/L，若有必要，可将样品进一步浓缩再进行测定；2)若样品吸光度低于标准品4.0μg/L的吸光度，并且接近空白孔的吸光度，则样品中MC-LR的浓度4.0μg/L，若有必要，可将样品进一步稀释再进行测定；3)上述两种情况的样品最终浓度要考虑浓缩/稀释倍数。九、注意事项1)使用前应按照说明书上试剂盒的组成内容，严格检查各项试剂是否齐全；并检查试剂盒是否超过有效期。2)试剂盒未使用时保存于2-8oC，使用前应取出平衡至室温，本说明书中的室温严格意义上应为-11-北京金达清创环境科技有限公司20-25oC，但经过试验，本试剂盒在20-40oC应用时也能取得较好的效果。3)开封后未使用的板条，应放入含有干燥剂的密封塑料袋中，4oC保存。4)吸头应一次性使用，加不同的样品/标准品或其它试剂时，每一次都应该更换吸头，避免交叉污染。5)为避免反应孔中落入异物以及反应溶液蒸发，反应时宜将整板放入洁净的密闭塑料袋中，或贴上贴纸，每步更换新的密封袋。6)加酶标二抗以前，应充分洗涤干净，以控制本底值在0.05以内。7)终止显色的时机很关键，由于环境条件(例如温度)、试剂盒存放长久以及操作等的不同，显色速度肯能够不同。因此，当看到阴性孔呈现亮蓝色甚至较深的蓝色，并且空白孔颜色很浅甚至为无色-12-北京金达清创环境科技有限公司透明时，即可终止显色反应。8)严格按说明书要求操作，操作过程不要漏加，不要错加，加液方法要正确。9)安全：因微囊藻毒素为剧毒物质，并且其它试剂(如终止液)也可能有危害，故整个过程应戴着手套进行操作。十、服务及购买信息在使用过程中，如出现任何疑问，请及时拨打技术服务热线：010-62785075订购热线：010-62789627;传真：[phone]账户名称：北京金达清创环境科技有限公司开户行：建行北京清华园支行帐号：11001079900053004072网址：@tsinghua.edu.cn-13-北京金达清创环境科技有限公司附录一、水样的浓缩对于浓度小于0.2μg/L的样品，如有必要，可采用固相萃取(Solidphaseextraction,SPE)对水样进行浓缩后再测定，步骤如下：采用BondElutC18固相萃取柱，先用5mL甲醇将柱活化，再用10mL高纯水中和萃取柱；然后将50mL样品加入萃取柱，流速控制在10mL/min；上样完毕用10mL5%甲醇溶液淋洗以净化去除固定相中的杂质；最后用1~2mL甲醇洗脱柱中的MCs，收集洗脱液于玻璃小瓶中。收集洗脱液在50℃下用氮气吹干，用1mL超纯水准确定容，即可进行检测(注意：原水样浓缩了50倍)。借助超声可使粘在玻璃小瓶上的MC-LR快速地溶解到溶剂中。-14-北京金达清创环境科技有限公司附录二、固体样品的处理对于固体样品，将其中的MC-LR提取出来，制备成水样，即可进行测定，步骤如下：1)准确称取一定量冷冻干燥后的固体样品（如水华藻粉最多只需1mg左右，其含MCs浓度较高，其它样品则可称取数克），加入2mL超纯水。2)用超声波细胞破碎机将细胞破碎，放入20mL玻璃瓶中，加入10ml5%(v/v)乙酸溶液，常温搅拌提取15min，然后7000g低温离心5min，取出上清液1。3)将残渣加入10ml80%甲醇提取15min，重复离心步骤，取出上清液2。4)残渣再用80%甲醇提取一次得到上清液3。5)合并2和3，用旋转蒸发仪(水浴温度40~45oC)浓缩近干，再将1合并进来得到溶液4。6)将溶液4按照附录一水样的浓缩步骤，进行-15-北京金达清创环境科技有限公司-16-固相萃取，最后可用10mL超纯水准确定容后，即可采用本试剂盒进行检测。注意1)测定结果与原固体样品中MC-LR实际浓度的换算关系。2)对于冷冻干燥后的动物组织，经乙酸提取后应继续用分析纯正己烷萃取出无用的脂肪，再进行固相萃取等操作。本说明书版权归北京金达清创环境科技有限公司所有，未经许可，不得摘抄、转载。维护您的微囊藻毒素免疫检测技术平台。金达清创的服务能确保其所有产品今后的质量、方便性、测量准确性及使用价值。敬请多提宝贵意见。谢谢！北京金达清创环境科技有限公司J&QEnvironmentalTechnologiesCo.,Ltd地址：北京市海淀区清华大学学研大厦B-1203邮编：100084电话：[phone]传真：[phone]E-mail:[e-mail]