检测相思子毒素BSA-ELISA条件的优化1-检测相思子

检测相思子毒素BSA-ELISA条件的优化1罗胜军王哲*高英杰李小兵刘国文谢光洪徐慧娟马惠海江涛孙广瑞（吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062）摘要:目的应用生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附法(BSA-ELISA)建立相思子毒素（Abrin）测定法,并初步应用人工污染香肠及生理盐水样品中相思子毒素回收率的检测。方法用兔抗相思子毒素多抗包被酶标板,加入待测抗原,并依次加入生物素化鼠抗相思子毒素单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的链霉亲合素,用磷酸对硝基苯酯显色。结果方法的线性范围为5～200ng/ml,检测下限为5ng/ml,批内变异系数为1.76%～4.64%,批间变异系数为5.96%～9.04%。结论该方法简便、快速,特异性、敏感性、重复性均在临床检测可接受范围内,标准曲线线性良好,适用于基础研究与临床检验。关键词:相思子毒素，生物素-链霉亲和素，BSA-ELISA前言：相思子毒素(abrin)是存在于豆科植物相思子(AbrusPreca-toriusL.)种子中的一种毒蛋白，与蓖麻毒素(ricin)同为Ⅱ型核糖体失活蛋白(RIP)家族成员，相思子毒素（abrin）是从其种子中提取的一种剧毒性高分子糖蛋白毒素,其相对分子量约为60kDa～65kDa的糖蛋白，分子由A、B两条多肽链通过一个二硫键连接而成[1]，其含量约占种子2.8%-3.0%，是迄今为此所发现的毒性昀强的植物毒素之一，国家自然基金重点项目，编号：30230260作者简介：罗胜军在读硕士（1974-男汉族安徽望江），研究方向：动物营养代谢及中毒病，吉林省长春市西安大路5333号吉林大学畜牧兽医学院，邮编:130062Tel:[phone]）E-mail:[e-mail]*通讯作者1毒性是普通化学武器的几百倍[2]。成年人摄入的致死剂量为5.0～7.0μg/kg，对小鼠的毒性是蓖麻毒素的75倍，只要毫克量即可致人死命，具备毒性高、中毒后无特殊的临床表现，诊断比较困难等生物毒素武器的典型特征。在斯里兰卡和印度就曾被非法用于毒杀牲畜乃至谋杀人的案例(Stirling，1924)。在2001年4月第23届国际生化及毒素武器大会（BTWC）中，相思子毒素再次被列入核查清单，本身就反映了人们对相思子毒素军事价值的关注。此外，由于相思子毒素是一种有效的蛋白质合成抑制剂，它在抗肿瘤方面的应用也引起广泛重视，对多种肿瘤细胞及几种人癌移植物有很强的抑制作用，可能成为一种极有前途的抗癌药物。因此，无论是从核查角度，还是为防护、治疗应用目的，开展对相思子毒素检测技术的研究，建立一种灵敏、快速的检测方法对于免疫毒素药代动力学研究、临床用药和相思子毒素中毒诊断、法医鉴定及反生物恐怖都具有重要的意义。本文用生物素-链霉亲合素酶联免疫吸附法（BSA-ELISA)测定相思子毒素,报告如下。1材料与方法1．1材料1．1．1试剂活化长臂生物素标记试剂盒（Sulfo-NHS-LC-BiotinylationKit）、碱性磷酸酶标记的链霉亲合素(AlkalinePhosphataseStreptavidin)、底物-磷酸对硝基苯酯（PNPP）均购自美国Pierce公司，相思子毒素标准品、兔抗相思子毒素多抗、鼠抗相思子毒素单2克隆抗体由本实验室提供；牛血清白蛋白、明胶、酪蛋白和卵清蛋白购自Genview公司；其它试剂均为进口分装或国产分析纯化学试剂；实验用水为超纯水或去离子水。1.1.2设备BS210S电子天平为美国赛多利斯(Sartorius)公司产品；超纯水仪为Millipore公司产品；HI98128型酸度计为意大利HANNA公司产品；酶联免疫检测仪为美国Bio-Rad550型；微量加样器为Gilson公司产品，96孔单条可拆酶标板为美国CORNING公司产品。1．2方法1．2．1生物素标记单抗:标记抗体按试剂盒说明书进行。1．2．2BSA-ELISA法工作流程:本实验采用生物素-链亲合素系统放大的ELISA(BSA-ELISA)方法,以Abrin多抗为包被抗体、生物素标记的Abrin单抗为标记抗体。(1)包被:将兔抗相思子毒素多抗用0.05mol/L,pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释后包被96孔酶标板,每孔100μl置4℃冰箱过夜，用洗液洗板4次拍干。(2)封闭:用封闭液200μl/孔封闭酶标板，37℃恒温箱中置2h，之后用洗液洗涤4次拍干，37℃置1.5h，干燥后，置4℃冰箱备用，即为反应板。(3)加待检样品:用稀释液将被检样品倍比稀释，每孔100μl，37℃置1.5h，之后，用洗液洗涤4次拍干。(3)加生物素标记单抗:将生物素标记单抗按工作浓度稀释，每孔100μl，37℃置1h，同上洗涤4次拍干。(4)加底物显色:显色前将底物PNPP溶解于底物缓冲液中(每2ml5.1mol/LpH=9.8的二乙醇胺加8ml超纯水，10ml该缓冲液溶解10mgPNPP)。每孔加1003μl，室温下显色15min，每孔50ul2N氢氧化钠终止反应，用自动酶标仪检测吸光度值。2方法学评价2.1包被条件选择3种缓冲液，即pH5.0、0.02mol/L枸橼酸盐缓冲液；pH7.4、0.01mol/L磷酸盐缓冲液及pH9.6、0.02mol/L碳酸盐缓冲液，结果以磷酸盐缓冲液包被后吸附毒素能力昀强，非特异性吸附昀小。包被的多抗浓度在6～12μg/ml时检测灵敏度高，本实验选择多抗的包被浓度为8μg/ml。2.2封闭剂的选择板包被后,还需封闭。微孔板是以聚苯乙烯为材料来吸附蛋白质,从而将抗体固相化。因为包被液中的蛋白不足以覆盖整个微孔底,封闭剂主要是一些蛋白溶液。经过封闭,可以掩盖微孔底部裸露的部位,减少非特异性吸附。这里试验了牛血清白蛋白、明胶、酪蛋白和卵清蛋白的封闭效果。(1)取酶标板一块,不包被,用200μl/孔封闭液封闭,置37℃恒温箱中2h。(2)洗板3次,200μl/孔,加二抗50μl/孔,37℃温育1h。(3)洗板6次,加底物显色。(4)加终止剂50μl/孔酶标仪上测吸光度值。结果,酪蛋白、卵清蛋白和明胶作为封闭剂,非特异性吸附较严重,而牛血清白蛋白作为封闭剂的本底较低,变异系数小,封闭效果较好,因此,1%牛血清白蛋白为昀佳封闭剂。2.3生物素化单克隆抗体及AP标记链霉亲合素浓度的选择采用矩阵法,即将不同浓度生物素化单抗以及AP标记链霉亲合素按BSA-ELISA法检测Abrin标准品,结果生物素化单抗稀释浓度为1μ4g/ml,AP-链霉亲合素稀释度为1∶500时,测得Abrin的A值与Abrin浓度曲线关系良好。2.4昀适反应时间固相多抗在37℃、1.5h内能昀大限度捕获待检品中的Abrin。生物素化单抗加入后的孵育时间以1h为昀佳，延长孵育时间后，非特异吸附增加而敏感度下降。AP链霉亲合素加入后的反应时间在45～60min之间为佳，反应时间不足降低检测Abrin的高限值，过长则明显增加本底值。2.5标准工作曲线的建立利用SPSS10.0统计软件进行曲线估计,拟合了三次曲线模型,本法测定Abrin的标准曲线Y=0.2019+0.0392X–0.0002X2+6*10-7X3(R2=0.997,P0.001)。当Abrin浓度在5～200ng/ml范围内,线性关系良好。本法测定Abrin标准品灵敏度可达5ng/ml。2.6阳性界值Abrin浓度为1ng/ml、5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml,所测得A值分别与本底比较。结果1ng/ml所测得A值大于本底2.1倍,P0.01,以1ng/ml为阳性标准。2.7重复性的测定取5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、和200ng/ml5种浓度的Abrin,每种浓度重复测定9次(每种浓度同时作12孔),Abrin的批内变异系数为1.76%～4.64%,批间变异系数5.96%～9.04%。2.8特异性实验5用蓖麻毒素、蓖麻凝集素、相思子凝集素三种类似物代替相思子毒素用本法测定,A值均低于0.01,本法与蓖麻毒素、蓖麻凝集素、相思子凝集素无交叉反应现象。3人工污染香肠及生理盐水样品中相思子毒素的回收率人工污染的香肠中相思子毒素平均回收率约为92.00%，变异系数为2.95%。人工污染的生理盐水中相思子毒素平均回收率约为85%，变异系数为5.09%。4讨论目前国内外有关相思子毒素的生物检定法和物理化学检定法报道较少，免疫学检测方法主要有放射免疫检测方法和酶联免疫吸附试验。Godal[3]用放射免疫方法分别对血液中的相思子毒素和蓖麻毒素进行检测，二者交叉反应小，可用于鉴别相思子毒素和蓖麻毒素，并监测血中的毒素浓度，血浆中相思子毒素昀小可测浓度达50～100pg/mL。Godal[4]等人建立ELISA法用于检测血浆中的抗相思子毒素抗体，但至今未见用ELISA法检测相思子毒素的报道。我国有关相思子毒素的检测方法主要为放射免疫方法。Hai[5]报导了相思子毒素的放射免疫检测方法。李丽琴[6]通过制备相思子毒素抗血清，建立了小鼠血浆体系相思子毒素的放射免疫检测方法，血浆中相思子毒素昀小可测浓度为0.2μg/L。早期采用的生物检定法和物理化学检定法鉴定相思子毒素，特异性及灵敏度差，HPLC法灵敏度高，但需要昂贵设备及专业技术，ELISA法特异、灵敏、快速、简便，可迅速检测大量样品，因而受到广泛重视，现已成为国际上检测生物毒素的常规方法之6一。由于相思子毒素是一种分子量较大（约为60kDa～65kDa）的糖蛋白，与相同体积、浓度、分子量较小的其它抗原相比较其分子数量较少，因此本室应用生物素-链霉亲和素放大系统建立测定相思子毒素的双抗体夹心BSA-ELISA检测方法。经过筛选,包被液采用pH7.5PBS液时抗体包被后活性昀佳,使用前4℃预冷。封闭液采用1g/L牛血清清蛋白(BSA)，封闭时间不宜超过2h,时间过长不但不能增加封闭效果,结合在板上的抗原反而会向封闭液内脱落,影响检测的灵敏度。样品稀释液采用pH7.4PBS内添加终浓度0.5g/LBSA和0.05%吐温-20,以降低非特异性吸附引起的显色。此测定法特异性、敏感性、重复性均在临床检测可接受范围内,标准曲线关系良好,可用于相思子毒素的定量研究，为昀终组装试剂盒做了技术储备。但本试验只是对BSA-ELISA方法初步探索。对于延长其保存时间本实验还未涉及。如何提高实验的精密度、灵敏度、结果的稳定性等还待继续进行研究。TheoptimizationtoBSA-ELISAfordetectionofAbrinLuoShengjunWangZheGaoYingjie(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,JilinUniversity,ChangchunJilin130062)Abstrace:ObjectiveTodevelopabiotin-streptavidin-enzyme-linkedimmunoso-rbentassay(BSA-ELISA)fordetectionofAbrinandinitialdetectionrecoveryrateoftheAbrininartificialsausageandSodiumChloride.MethodsThemainstepsoftheBSA-ELISAwereasfollows:96wellplateswerecoatedwithRbtpolyclonalanti-bodytoAbrin.After7addingAbrinstandardsorsamples,biotinylatedspecificratMabtoAbrin,AlkalinePhosphataseStreptavidin,thenaddedandthecolourwasrevea-ledwithPNPP.ResultsTheworkingrangeofstandardcurvewas1～200ng/ml,andtheminimumdetectab