牛γ干扰素抗原捕获ELISA检测方法的建立及初步应用

扬州大学硕士学位论文牛γ干扰素抗原捕获ELISA检测方法的建立及初步应用姓名：牛中伟申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：焦新安20090601牛γ干扰素抗原捕获ELISA检测方法的建立及初步应用作者：牛中伟学位授予单位：扬州大学相似文献(10条)1.期刊论文牛结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的原核表达及其在牛结核病检测中的应用-中国兽医科学2009,39(9)采用重组PCR技术从牛结核分枝杆菌AN5基因组DNA中扩增CFP10-ESAT6融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a,构建了原核表达质粒pET-CFP10/ESAT6.重组子经酶切及测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳鉴定,获得约42ku带有6×His蛋白标签的rHIS-CFP10/ESAT6融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的40%.用HIS蛋白纯化柱纯化该蛋白,Western-blot分析显示,该融合蛋白能与抗牛结核分枝杆菌阳性血清发生特异性反应.将重组的该融合蛋白用于刺激单次皮内变态反应阳性牛全血,可以产生高水平的IFN-γ,其特异性优于结核菌素.结果表明,获得的重组融合蛋白rHIS-CFP10/ESAT6为牛结核病的诊断奠定了基础.2.会议论文蔡宏.呼西旦.李淑霞.黄丽茜.艾海提·司马义.王元江.刘东生.窦大庆利用TB-PCR试剂盒对牛结核病的检测2006应用聚合酶链式反应(PCR)技术制备的TB-PCR试剂盒对来自新疆6个牛场的238份血样、奶样、口腔分泌物标本中结核分枝杆菌进行检测,结果显示:TB-PCR试剂盒对40份奶样标本进行检测,7头牛为阳性.阳性检出率17.5％.TB-PCR试剂盒对178份血样标本的检测,23头牛为阳性,阳性检出率为12.92％.TB-PCR试剂盒对20份口腔分泌物标本中结核分枝杆菌检测结果均为阴性.本试验中共计检测6个牛场的238份不同标本的PCR阳性牛共计27头,阳性检出率为3.02％.将PCR和传统的PPD检测方法的结果比较显示出PPD检出阳性率高于PCR,PPD检出阳性牛39头,检出阳性率6.7％.本试验对口腔分泌物标本的检测结果不理想.总之,TB-PCR试剂盒在检测牛结核病不同标本中显示出快速、特异等优点.为今后牛结核病的检测工作提供了一条新途径.3.学位论文李卫民牛结核分枝杆菌蛋白组分析及分类鉴定2006牛结核病(bovinetuberculosis)已被国际兽医局(OIE)列为B类动物疫病，是由牛型分枝杆菌(Mycobacteriumboyis)和结核分枝杆菌(MYcobacteriumtuberculosis)等结核分枝杆菌复合群菌株所引起的一种慢性消耗性传染病。牛患结核病后，主要表现为乳房炎和结核性胸膜炎等症状，造成牛奶及相关食品的数量和品质下降。同时牛结核病还能够传染给人，引起人畜共患病。本研究构建结核分枝杆菌(H,37Rv)、牛型分枝杆菌减毒株M.bovisBCG的双相凝胶电泳图谱。以高通量的方法展示牛结核分枝杆菌的蛋白组，该工作为证实抗原和发现新抗原提供了依据，也为探讨牛结核发病机制提供了一项技术平台。目前分枝杆菌属的其它种(如鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)以及其亚种副结核分枝杆菌(Mycobacteriumparatuberculosis)也能引起牛群感染和致病。因此有必要摸索一种快速、准确鉴定分枝杆菌的方法。本研究采用16SrDNA序列分析和表型鉴定分析我国第四次结核病流行病学抽样调查的44株非结核分枝杆菌，11株分枝杆菌生化鉴定无法分类，而16SrDNA序列分析确定了它们在分枝杆菌属中的地位。可见16SrDNA和ITs序列分析方法分析分枝杆菌属和种较适合。采用16SrDNAandITS序列和全细胞脂肪酸气相色谱分析广州地区70份非结核分枝杆菌，全细胞脂肪酸气相色谱分析将70份标本中67株分枝杆菌确定了分类地位，可见全细胞脂肪酸气相色谱方法分析分枝杆菌菌株快速、准确。全细胞脂肪酸气相色谱分析与16SrDNAandITS序列分析的结果相比，仅存在3株(3/70)不一致的鉴定。16SrDNA和ITS序列分析和全细胞脂肪酸气相色谱分析方法相结合的多相分类对分枝杆菌属中的种的鉴定更为准确、自然。本研究以我国第四次结核病流行病学抽样调查(简称流调)为依托，构建Spoligotyping和VNTR两种基因分型方法，分析流调获得的441份分枝杆菌。分析证实：在我国存在一个遗传关系较近的结核分枝杆菌基因型…北京基因型，且呈较高频率流行64.9％(265/408)。同时采用上述两种基因分型方法分析8株牛分枝杆菌(含2株标准和6株中国兽医菌种目录的牛型分枝杆菌，均经表型鉴定)，6株来自世界各地的BCG女儿株和3株分离自新疆PPD(+)病牛的分枝杆菌。结果提示2株标准牛型分枝杆菌和6株BCG菌株为特征性牛分枝杆菌Spoligotyping指纹图谱。6株中国兽医菌种目录和3株新疆分离株中4株为结核分枝杆菌，其余为牛型分枝杆菌。这一结果再次从核酸水平证实：牛结核病不但由牛分枝杆菌引起，也由结核分枝杆菌引起。牛结核病是一种人畜共患病。深入研究人结核病的分子流行病学对开展牛结核病分子流行病学工作提供重要理论指导和实验依据。4.会议论文林世禄乳牛结核病的防治措施2007乳牛结核病是由牛结核分枝杆菌引起的人畜共患慢性传染病。该病可通过病牛传染给人类或其他牛。在我国仍是最常见的疾病之一,早在1960年世界卫生组织就指出:在那些还流行牛结核病的国家中,人类始终受到该病的威胁,除非消灭牛结核病,否则人类结核病的控制是不会成功的。目前随着交通的便捷,乳牛的流通加快,检疫难度加大,乳牛结核病的传播也加快。鉴于目前乳牛结核病的防治存在一些漏洞,为了有效地控制该病,保证人、畜的健康,该文就防治乳牛结核病提出几点措施。5.学位论文张君牛结核分枝杆菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立2009牛结核病主要是由牛结核分枝杆菌引起的一种慢性消耗性人兽共患传染病。在奶牛中最为常见，可通过接触及饮用未消毒的牛奶等多种方式感染人，因此牛结核病快速检测方法的研究具有重大公共卫生学意义。为有效防止人和动物之间的相互传染，彻底控制和净化牛结核病，急需开展牛结核病的快速检测方法的研究以及研制开发商品化检测试剂盒。为此，本研究建立了牛结核分枝杆菌的环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法，同时应用细菌学检测和PCR方法对其进行了验证，并且通过临床样品的检测对其进行了论证。本实验将牛结核分枝杆菌标准株先接种于Midddlebrook7H9液体培养基增菌，继之接种于Midddlebrook7H9固体培养基培养。用Ziehl—Neelsen氏抗酸染色法染色，镜检发现细长平直或稍弯曲的抗酸染色阳性(红色)杆菌。根据GenbankTM已发表的MTBMPT83序列设计合成1对特异性的PCR鉴定引物(上游引物TB—F和下游引物TB—R)，以标准牛结核分枝杆菌为模板，用PCR的方法扩增出长度为850bp特异性片断，将其克隆到pMD—18T载体上，重组质粒经PCR鉴定均为阳性。利用PrimerExplorerV4LAMP专业设计软件(https：//primerexplorer．jp/lamp4.0.0/index．html)，设计两对特异性引物F3/B3，FIP/BIP，以及一对环引物LoopF/LoopB，该组引物扩增区域包含引物TB—F和TB—R扩增区域。对三对引物、MgSO4、Betaine、BstDNAPoLymerase和dNTP分别进行优化，建立了LAMP检测方法，并对其进行敏感性、特异性和稳定性的试验。牛结核分枝杆菌LAMP检测结果通过琼脂糖凝胶电泳、颜色变化和反应物沉淀等方法来判定。同时运用PCR和LAMP两种方法对有PPD鉴定史的250份(40份为PPD疑似阳性)痰液临床样品进行了检测结果的比较。实验结果表明，在250份临床采集牛痰液的结核杆菌检测中，其中40份经结核菌素皮内注射检测得到的疑似阳性结果；用引物TB—F和TB—RPCR扩增时，得到33份阳性产物，阳性率为13.2％；用LAMP方法检测，得到40份阳性产物，阳性率为16％。LAMP方法与PCR方法、PPD试验及传统的细菌学检查结果有较高的符合率，具有较高的特异性、敏感性和稳定性。本研究为牛结核病快速检测试剂盒的研制和开发奠定了良好的基础。6.期刊论文胡杰.陆光涛我国牛结核病的研究进展-畜牧兽医科技信息2005,(5)牛结核病(BovineTuberculosis)主要是由牛结核分枝杆菌引起的一种人畜共患的慢性传染病.该病因其易传染,且能通过奶制品传染给人和犊牛,危害严重,被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物疫病,我国将其列为二类动物疫病.本病的特点是组织器官形成结节状肉芽肿、消瘦、体重减轻等.本病最早由Villemin在1865年用兔证明牛的珍珠病相当于人的结核病,Koch在1882年发现牛的结核病的病原.美国于1917年首次出现牛结核病,并及时提出根除计划,墨西哥、西班牙等国家均有该病的报导,我国的黄牛、水牛、猪及野生鹿、鸡等也有报导,1996年世界动物卫生组织(OIE)还确定全球进入结核病紧急状态.目前北殴的丹麦、比利时、德国等国基本消灭了牛结核病,英国、法国处于控制状态,而西班牙的牛结核病感染率为10%.我国结核病的研究比较滞后,虽然政府加大防疫监管力度,但近年来奶牛结核病还时有发生,如2003年广东发生奶牛结核病,引起多方关注,还一度引发市民恐慌.因此非常有必要加强牛结核病的研究.现将对近年来我国牛结核病的研究作一简单论述.7.学位论文徐贤坤水牛γ-干扰素单克隆抗体制备及水牛结核病夹心ELISA检测方法的初步建立2009牛结核病（tuberculosis，TB）是由牛结核分枝杆菌引起的慢性消耗性疾病，呈世界性分布。牛结核病的诊断方法主要有病原鉴定和皮内变态反应。细菌学检查需要5～8周时间，检出率低，且常有假阴性结果出现而不适合于流行病学调查和日常监测；结核菌素（PPD）皮内变态反应（TST）是国际贸易指定试验，该法技术简单，价格低廉，但其非特异性强，不是理想的牛结核病诊断方法；而且该检测方法只是针对牛属结核病检测设定，不适用于水牛属、羊等家畜及其他的野生动物结核病诊断。抗原特异性γ-干扰素试验是一种新型体外T细胞免疫检测试验，由于新的结核杆菌特异性抗原CFP10，ESAT6等的发现，提高了检测的敏感性和特异性，其应用于牛结核病的诊断受到广大研究者的关注。然而，目前该法的研究对象主要集中在牛属动物，而未见水牛属结核病检测方法的报道。针对近年来我国南方水牛规模不断扩大，养殖密度不断增加，水牛结核病感染率和发病率急剧攀升却无适合的方法开展检疫的现状，本研究拟利用抗原特异性γ-干扰素原理，建立一种适用于水牛结核病检测的方法，为水牛结核病诊断提供一种新的手段，为检疫和控制水牛结核病提供技术支持。主要的研究工作和成果如下：1、提取经刀豆素（ConA）诱导培养的水牛外周血淋巴细胞培养物总RNA，通过RT-PCR扩增出水牛IFN-γ（WBIFN-γ）前体的cDNA序列，然后将其定向克隆入PMD18-T质粒中，构建重组质粒PMD18-T-WBIFN-γ，并进行测序。序列分析结果表明，克隆获得的IFN-γ基因全长为544个碱基，水牛IFN-γ基因开放阅读框（ORF）为501个碱基，编码166个氨基酸，基因登录号为EF567075。与GenBank上已发表的水牛、牛的IFN-γ基因进行同源性比较，其核苷酸同源性均高于97％，推导氨基酸同源性高于96％。通过亚克隆从重组质粒PMD18-T-WBIFN-γ中扩增出WBIFN-γ的成熟肽段序列，并将其定向插入原核表达载体pGEX-6P-1和PET-32a，经DNA测序确认后，分别转化至BL21（DE3）重组菌，经IPTG诱导表达后，pGEX-WBIFN-γ/BL21与PET-WBIFN-γ/BL21重组菌各自表达出相对分子量分别为43Ku和37．4Ku左右的融合蛋白