GBZT 328-2023 放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞微核检测方法与受照剂量估算标准

ICS13.100CCSC60GBZ中华人民共和国家职业卫生标准GBZ/T328—2023代替WS/T187—1999放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞微核检测方法与受照剂量估算标准Standardforthemethodofmicronucleusdetectioninlymphocytesonoccupationalhealthexaminationforradiationworkersandexposuredoseestimation2023-03-07发布2023-09-01实施中华人民共和国国家卫生健康委员会发布GBZ/T328—2023I目次前言.............................................................................II1范围...........................................................................12规范性引用文件.................................................................13术语和定义.....................................................................14标本采集与微量全血培养.........................................................25微核标本制备...................................................................26微核分析.......................................................................27检测结果判断...................................................................38检测报告与归档.................................................................39剂量-效应标准曲线的建立........................................................310剂量估算......................................................................411质量控制......................................................................512CB微核法估算剂量的原则........................................................5附录A（规范性）主要仪器设备和试剂配制...........................................6附录B（资料性）微核分析记录表和微核检测报告单...................................7附录C（资料性）放射事故受照人员生物剂量估算应用示例.............................9附录D（规范性）正确使用本标准的说明............................................10参考文献.........................................................................11GBZ/T328—2023II前言本标准代替WS/T187—1999《淋巴细胞微核估算受照剂量方法》。与WS/T187—1999相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：a)在范围中增加了“放射工作人员职业健康检查和受照剂量估算中，外周血淋巴细胞微核的标本制备、微核检测、结果评价、剂量估算方法和质量控制。”适用范围增加了“放射工作人员职业健康检查微核检测”（见第1章）；b)增加了规范性引用文件（见第2章）；c)术语和定义中删除了“生物剂量计”和“松胞素-B”（见WS/T187—1999的2.1和2.5），增加了“生物剂量估算”“常规培养微核法”和“微核率”（见3.1、3.3和3.6），更改了“微核”（见3.2，见WS/T187—1999的2.3）d)删除了“剂量-效应曲线的建立方法”（见WS/T187—1999的第3章）；e)增加了“标本采集与微量全血培养”“微核标本制备”“微核分析”“检测结果判断”“检测报告与归档”“剂量-效应标准曲线的建立”“剂量估算”和“质量控制”（见第4章～第11章）；f)更改了“CB微核法估算受照剂量的原则”（见第12章，WS/T187—1999的第4章）；g)更改了正确使用本标准的说明（见附录D，WS/T187—1999的附录A）；h)增加了附录A主要仪器设备和试剂配制（见附录A）；i)增加了附录B微核分析记录表和微核检测报告单（见附录B）；j)增加了附录C放射事故受照人员生物剂量估算应用示例（见附录C）；k)增加了参考文献。本标准由国家卫生健康标准委员会放射卫生标准专业委员会负责技术审查和技术咨询，由中国疾病预防控制中心负责协调性和格式审查，由国家卫生健康委职业健康司负责业务管理、法规司负责统筹管理。本标准起草单位：中国医学科学院放射医学研究所、中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所、河南省职业病防治研究院、苏州大学。本标准主要起草人：刘强、刘青杰、吕玉民、郝建秀、王彦、李爽、韩林、陈娜、李旭光、姜恩海。本标准于1999年首次发布为WS/T187—1999，本次为第一次修订。GBZ/T328—20231放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞微核检测方法与受照剂量估算标准1范围本标准规定了放射工作人员职业健康检查和受照剂量估算中，外周血淋巴细胞微核的标本制备、微核检测、结果评价、剂量估算方法和质量控制。本标准适用于放射工作人员职业健康检查微核检测和急性全身外照射受照人员的剂量估算。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GBZ/T248放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞染色体畸变检测与评价3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1生物剂量估算biologicaldoseestimation用具有稳定剂量-效应关系的分子或亚细胞结构变化等生物学指标定量估算受照射个体的辐射吸收剂量的方法。3.2微核micronucleus由于基因组DNA损伤导致细胞分裂后期滞后的染色体断片、一个或多个染色体不能随有丝分裂进入子细胞，而在细胞质中形成直径小于主核的三分之一且完全与主核分开的圆形或椭圆形小核。3.3常规培养微核法routinemicronucleusmethod采用微量全血培养法培养淋巴细胞，培养结束后经低渗、固定、制片和染色进行观察和分析微核的方法。3.4胞质分裂阻断微核法cytokinesis-blockmicronucleusmethodCB微核法在培养的淋巴细胞完成第一次有丝分裂前，向培养体系中加入松胞素-B，阻滞胞质分裂，培养结束后经低渗、固定、制片和染色，只计数和分析双核淋巴细胞中微核的方法。3.5微核细胞micronucleuscell如采用常规培养微核法，指胞质中含有微核的转化淋巴细胞；如采用CB微核法，指胞质中含有微核的双核淋巴细胞。3.6微核率micronucleusfrequency如采用常规培养微核法，指每1000个转化的淋巴细胞中含有的微核数；如采用CB微核法，指每1000个双核淋巴细胞中含有的微核数。GBZ/T328—202323.7剂量-效应曲线dose-effectcurve描述生物效应依赖于剂量变化方式的曲线。4标本采集与微量全血培养主要仪器和试剂配制4.1主要仪器和试剂配制参见附录A。外周静脉血采集4.2采集静脉血约2mL，肝素抗凝，颠倒混匀，静脉血保存最佳温度是18℃～24℃，72h内送达实验室。微量全血培养步骤4.34.3.1将采集的静脉血0.3mL～0.5mL加入4mL～5mL含植物血凝素和10%～20%胎牛血清的洛斯维帕克纪念研究所-1640（RPMI-1640）培养基中，在培养容器上编号并注明培养开始时间和日期，轻轻摇匀，37℃±0.5℃恒温培养。4.3.2如采用常规培养微核法，培养至68h～72h收获细胞。4.3.3如采用胞质分裂阻断微核法，培养至40h～44h，加入松胞素-B，使其终浓度为6μg/mL，继续培养至72h收获细胞。5微核标本制备低渗5.1吸弃培养液上清，摇匀，每管加入4mL37℃预温的KCl低渗液（常规培养法低渗液浓度宜为0.075mol/L，CB微核法低渗液浓度宜为0.1mol/L），轻轻吹打均匀，立即加入新配制的固定液0.5mL～1mL（甲醇：冰醋酸体积比3：1），混匀，移至10mL～15mL离心管中，水平离心机离心8min～10min，离心力为200g～250g。固定5.2弃上清，摇匀，加入4.5mL固定液，固定20min～30min，水平离心机离心8min～10min，离心力为200g～250g。离心后可用固定液洗涤细胞，以减少细胞悬液中的杂质。制片5.3弃上清，视细胞数量酌情加入固定液数滴，充分混匀，将细胞悬液均匀滴在洁净干燥载玻片上，室温干燥。编号5.4对每一张微核标本玻片进行编号，并做好记录。染色5.5用体积比为8%～10%的瑞氏-吉姆萨染液或吉姆萨染液染色8min～10min，轻轻冲洗，室温干燥。6微核分析阅片6.1GBZ/T328—20233盲法阅片。按显微镜载物台刻度坐标，从右至左逐列或逐行对每张微核标本玻片进行扫描式阅片，常规培养微核法寻找转化的单核淋巴细胞，如果采用CB微核法，即寻找双核淋巴细胞，对每位受检者至少分析1000个转化淋巴细胞。双核淋巴细胞的判定标准6.2细胞应为双核细胞，同一个双核细胞中的两个细胞核应具有各自完整的核膜，并位于相同的细胞质边界内，两个细胞核大小、质感和染色强度应大致相等，两个细胞核完全分离，或者可由一个或多个核质桥连接，核质桥不超过核直径的1/4，两个细胞核重叠时，应看到各自的完整核膜。双核细胞的细胞质边界或细胞膜应完整，并与相邻细胞的细胞质边界明显区分。微核的判定标准6.3微核应游离于胞质中，与主核完全分开，直径为主核的1/16～1/3，与主核不连接，不重叠（重叠或相切时，应看到各自的完整核膜），无折光性，与染料颗粒等杂质相区别，着色深浅与主核相同或略浅。分析和记录6.4常规培养微核法观察转化的单核淋巴细胞，CB微核法观察双核淋巴细胞，如发现微核，应在微核分析记录表中记录显微镜坐标，有条件的机构可拍照，在微核分析记录表中记录图片文件名，以备复核。微核分析记录表样式参见附录B。7检测结果判断常规培养法微核率的正常参考值范围0～6‟；CB法微核率的正常参考值范围0～30‟。7.1对检测结果超出正常参考值范围者，可检查外周血淋巴细胞染色体畸变。7.28检测报告与归档对每位受检者应出具外周血微核检测报告单。检测报告单样式参见附录B。8.1检测的微核标本应保存两年。微核记录表等原始资料应建档长期保存，并建立电子档案。8.29剂量-效应标准曲线的建立样品要求9.1采血前应获取志愿者的知情同意。志愿者2名～4名健康成年人，非放射工作者，男女各半，年龄在18岁～60岁，无烟酒嗜好，半年内无急慢性疾病史、无射线和化学毒物接触史，近一个月内无病毒感染史。抽取静脉血6mL～8mL，注入肝素抗凝管。照射、培养和分析9.29.2.1应提供可靠的、明确的照射样品的物理剂量。受照样品应与照射源保持一定的距离以达到均匀照射的目的