GB 5009.211-2022 食品安全国家标准 食品中叶酸的测定

书书书中华人民共和国国家标准犌犅５００９．２１１—２０２２食品安全国家标准食品中叶酸的测定２０２２０６３０发布２０２２１２３０实施中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局发布书书书犌犅５００９．２１１—２０２２Ⅰ　　　　前　　言　　本标准代替ＧＢ５００９．２１１—２０１４《食品安全国家标准　食品中叶酸的测定》。本标准与ＧＢ５００９．２１１—２０１４相比，主要变化如下：———增加了微孔板测定方法；———修改了精密度要求；———修改了附录Ａ。犌犅５００９．２１１—２０２２１　　　　食品安全国家标准食品中叶酸的测定１　范围本标准规定了食品中叶酸的测定方法。本标准适用于食品中叶酸的测定。２　原理叶酸是鼠李糖乳杆菌（犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊狉犺犪犿狀狅狊狌狊）生长所必需的营养素。在一定控制条件下，将鼠李糖乳杆菌菌液接种至含有试样液的培养基中，培养一段时间后测定透光率（或吸光度值），在一定测定范围内可以根据叶酸含量与透光率（或吸光度值）的标准曲线计算出试样中叶酸的含量。３　试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的二级水。３．１　试剂３．１．１　盐酸（ＨＣｌ）。３．１．２　氢氧化钠（ＮａＯＨ）。３．１．３　氯化钠（ＮａＣｌ）。３．１．４　十二水合磷酸钠（Ｎａ３ＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）。３．１．５　七水合磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·７Ｈ２Ｏ）。３．１．６　Ｌ抗坏血酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ６）。３．１．７　甲苯（Ｃ７Ｈ８）。３．１．８　无水乙醇（Ｃ２Ｈ６Ｏ）。３．１．９　鸡胰腺冻干粉：含γ谷胺酰基水解酶。３．１．１０　木瓜蛋白酶：酶活力≥５Ｕ／ｍｇ。３．１．１１　α淀粉酶：酶活力≥１．５Ｕ／ｍｇ。３．２　试剂配制３．２．１　磷酸盐缓冲液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ６．８）：分别称取４．３５ｇ十二水合磷酸钠和１０．３９ｇ七水合磷酸氢二钠，加水溶解并定容至１Ｌ，混匀。加入２ｍＬ甲苯，室温保存。临用前按约５ｍｇ／ｍＬ的比例加入Ｌ抗坏血酸作为叶酸保护剂，调节ｐＨ至６．８±０．１。３．２．２　２０％乙醇溶液（２＋８）：量取２００ｍＬ无水乙醇与８００ｍＬ水混匀。３．２．３　氢氧化钠乙醇溶液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ）：称取０．４ｇ氢氧化钠，用２０％乙醇溶液溶解并定容至１Ｌ，混匀。３．２．４　氢氧化钠溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）：称取４０ｇ氢氧化钠，加水溶解并定容至１Ｌ，混匀。犌犅５００９．２１１—２０２２２　　　　３．２．５　盐酸浸泡液：量取１００ｍＬ盐酸（浓度３６％～３８％）与５０倍水混合。３．２．６　鸡胰腺溶液：称取１００ｍｇ鸡胰腺冻干粉，加入２０ｍＬ磷酸盐缓冲液，摇匀。现用现配。３．２．７　蛋白酶淀粉酶液：分别称取２００ｍｇ木瓜蛋白酶和α淀粉酶，加入２０ｍＬ磷酸盐缓冲液研磨至匀浆，３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。现用现配。３．３　培养基３．３．１　菌种储备用琼脂培养基：按Ａ．１配制。３．３．２　叶酸测定培养基：按Ａ．２配制。　　注：以上培养基也可用商品化的合成或成品培养基，用前按说明书配制。３．４　标准品叶酸标准品（Ｃ１９Ｈ１９Ｎ７Ｏ６，ＣＡＳ：５９３０３）：纯度≥９７％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。３．５　标准溶液的配制３．５．１　叶酸标准储备液（２０．０μｇ／ｍＬ）：准确称取２０．０ｍｇ叶酸标准品，用氢氧化钠乙醇溶液溶解，转移并定容至１０００ｍＬ棕色容量瓶中。将溶液转移至棕色玻璃容器中，于２℃～４℃冰箱避光保存，保存期２年。３．５．２　叶酸标准中间液（０．２００μｇ／ｍＬ）：准确吸取１．００ｍＬ叶酸标准储备液置于１００ｍＬ棕色容量瓶中，用氢氧化钠乙醇溶液稀释并定容至刻度，混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器中，于２℃～４℃冰箱避光保存，保存期１年。３．５．３　叶酸标准工作液（０．２００ｎｇ／ｍＬ）：准确吸取１．００ｍＬ叶酸标准中间液置于１０００ｍＬ容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，混匀。现用现配。４　仪器和设备４．１　天平：感量为０．１ｍｇ和１ｍｇ。４．２　恒温培养箱：３６℃±１℃。４．３　高压灭菌锅。４．４　涡旋振荡器。４．５　离心机：３０００ｒ／ｍｉｎ。４．６　接种环和接种针。４．７　ｐＨ计：精度为±０．１。４．８　组织粉碎机和研磨仪。４．９　紫外可见分光光度计。４．１０　超净工作台。４．１１　超声波振荡器。４．１２　酶标仪。４．１３　离心管。４．１４　微孔板（无菌）。４．１５　滤膜（０．２２μｍ）。４．１６　容量瓶。　　注：所用玻璃器具使用前用盐酸浸泡液或月桂基磺酸钠洗涤剂清洗干净后，２５０℃干热１ｈ～２ｈ。犌犅５００９．２１１—２０２２３　　　　５　菌种的制备与保存５．１　菌种鼠李糖乳杆菌犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊狉犺犪犿狀狅狊狌狊（ＡＴＣＣ７４６９）或等效菌株。５．２　储备菌种的制备将菌种鼠李糖乳杆菌转接至菌种储备用琼脂培养基中，在３６℃±１℃恒温培养箱中培养２０ｈ～２４ｈ，连续传种２代～３代。取出后放入２℃～４℃冰箱作为储备菌株保存。实验前将储备菌株接种至菌种储备用琼脂培养基中，在３６℃±１℃恒温培养箱中培养２０ｈ～２４ｈ以活化菌株，用于接种液的制备。　　注：保存２周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，实验前宜连续传种２代～３代以保证细菌活力。５．３　接种液的制备实验前一天，取２ｍＬ叶酸标准工作液与４ｍＬ叶酸测定用培养基混匀，分装至２支试管中，于１２１℃（０．１０ＭＰａ～０．１２ＭＰａ）高压灭菌１５ｍｉｎ（或根据培养基标签标识进行灭菌）后即为种子培养液。冷却后用接种环将活化的菌株转种至２支种子培养液中，于３６℃±１℃恒温培养箱中培养２０ｈ～２４ｈ。取出后将种子培养液混悬，无菌操作下吸取０．５ｍＬ转种至５ｍＬ不加叶酸标准工作液的无菌叶酸测定培养基中，于３６℃±１℃再培养６ｈ，以消耗种子培养液中残存在菌株中的多余叶酸，制成接种液。６　分析步骤（所有操作均需避光进行）６．１　试样制备谷物类、豆类、乳粉等试样需粉碎、研磨、过筛（筛板孔径０．３ｍｍ～０．５ｍｍ）；肉、蛋、坚果等用均质器制成食糜；果蔬、半固体食品等试样需匀浆混匀，也可采用冷冻干燥粉碎法混匀；液体试样用前振摇混合。上述制备的试样于２℃～４℃冰箱可保存１周。６．２　试样提取６．２．１　直接提取法测定样品中添加的叶酸含量时，可采用直接提取法。准确称取固体试样０．１ｇ～２ｇ或液体试样０．５ｍＬ～２ｍＬ，精确至０．００１ｇ，转入锥形瓶中，加入８０ｍＬ氢氧化钠乙醇溶液，具塞，超声振荡０．５ｈ～４ｈ至试样完全溶解或分散，转入１００ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度。６．２．２　酶解提取法谷薯类、肉蛋乳类、果蔬菌藻类、豆类及坚果类等食品试样中天然存在的叶酸宜采用酶解提取法。准确称取适量试样（含０．２μｇ～２μｇ叶酸），精确至０．００１ｇ。一般谷薯类、肉类、乳类、新鲜果蔬、菌藻类试样２ｇ～５ｇ；蛋类、豆类、坚果类、内脏、干制试样０．２ｇ～２ｇ；流质或半流质试样５ｇ～１０ｇ。转入１００ｍＬ锥形瓶中，加３０ｍＬ磷酸盐缓冲液，振摇５ｍｉｎ后，具塞，于１２１℃（０．１０ＭＰａ～０．１２ＭＰａ）高压水解１５ｍｉｎ。试样取出后冷却至室温，加入１ｍＬ鸡胰腺溶液、１ｍＬ蛋白酶淀粉酶液，混合。加入３滴～５滴甲犌犅５００９．２１１—２０２２４　　　　苯后，置于３６℃±１℃恒温培养箱内酶解１６ｈ～２０ｈ。取出，转入１００ｍＬ容量瓶，加水定容至刻度，过滤。另取一只锥形瓶，不加试样，其他步骤同试样操作，作为酶空白液。　　注：以谷物、乳粉等为基质的配方食品如需计量基质本底叶酸含量，可采用酶解法提取。６．３　稀释根据试样中叶酸含量用水对试样提取液进行适当稀释，使试样稀释液中叶酸含量在０．２ｎｇ／ｍＬ～０．３ｎｇ／ｍＬ范围内。６．４　试样测定６．４．１　试管法６．４．１．１　试样和酶空白系列管取３支试管，分别加入１．０ｍＬ、２．０ｍＬ、３．０ｍＬ试样稀释液（犞狓），补水至５．０ｍＬ，混匀。另取３支试管同法加入酶空白液。每个梯度做２个平行。６．４．１．２　标准系列管取试管分别加入叶酸标准工作溶液０．００ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．５０ｍＬ、１．００ｍＬ、１．５０ｍＬ、２．００ｍＬ、２．５０ｍＬ、３．００ｍＬ、４．００ｍＬ和５．００ｍＬ，补水至５．００ｍＬ，相当于标准系列管中叶酸含量为０．００ｎｇ、０．０５ｎｇ、０．１０ｎｇ、０．２０ｎｇ、０．３０ｎｇ、０．４０ｎｇ、０．５０ｎｇ、０．６０ｎｇ、０．８０ｎｇ和１．００ｎｇ，混匀。制备２套～３套标准系列管，绘制标准曲线时，以每个标准点平均值计算。６．４．１．３　灭菌将所有测定系列管、叶酸测定培养基于１２１℃（０．１０ＭＰａ～０．１２ＭＰａ）高压灭菌１５ｍｉｎ（或根据培养基要求进行灭菌）。６．４．１．４　接种和培养待测定系列管冷却至室温后，在无菌操作条件下，每１０ｍＬ叶酸测定培养基加入接种液４０μＬ，混匀，每支测定管中加入接种后的叶酸测定培养基５ｍＬ，混匀。置于３６℃±１℃恒温培养箱中培养２０ｈ～４０ｈ，获最大混浊度时终止培养。另准备一支标准０管（含０．００ｎｇ叶酸）不接种作为０对照管。６．４．１．５　测定将培养好的标准系列管、试样和酶空白系列管用漩涡振荡器混匀。用１ｃｍ比色杯，于５４０ｎｍ处，以未接种０对照管调节透光率为１００％（或吸光度值为０），依次测定标准系列管、试样和酶空白系列管的透光率（或吸光度值）。如果０对照管出现浑浊，说明可能有杂菌污染，需重做实验。　　注：适宜的测定光谱范围为５４０ｎｍ～６１０ｎｍ。６．４．２　微孔板法６．４．２．１　试样系列管先将６．３试样稀释液无菌条件下用无菌水相滤膜（０．２２μｍ）过滤除菌，取３支１．５ｍＬ无菌离心管，分别加入１００μＬ、２００μＬ、３００μＬ试样稀释液，补无菌水至５００μＬ。每个梯度做２个平行。犌犅５００９．２１１—２０２２５　　　　６．４．２．２　标准系列管按６．４．１．２中标准溶液的制备方式，体积按比例缩减至１．０ｍＬ后，在无菌条件下过滤除菌至无菌离心管中。制备２套～３套标准系列管，绘制标准曲线时，以每个标准点平均值计算。６．４．２．３　接种和培养叶酸测定培养基高压灭菌冷却后，每１０ｍＬ培养基中加入菌种接种液４０μＬ，混匀，吸取１５０μＬ加入微孔板中。另吸取１５０μＬ标准系列管或试样系列管加入微孔板中，覆膜，混匀，置于３６℃±１℃恒温培养箱中培养３２ｈ～４０ｈ。６．４．２．４　测定混匀微孔板中培养物，用酶标仪在５４０ｎｍ处测定吸光度值。如果０对照孔出现浑浊，说明可能有杂菌污染，需重做实验。　　注：适宜的测定光谱范围为５４０ｎｍ～６１０ｎｍ。７　分析结果表述７．１　标准曲线以标准系列管叶酸含量为横坐标，每个标准点透光率（或吸光度值）均值为纵坐标，绘制标准曲线。７．２　试样结果计算从标准曲线计算试样或酶空白系列管中叶酸的相应含量（犮狓），如果３支试样系列管中有２支叶酸含量在０．１０ｎｇ～０．８０ｎｇ范围内，且各管之间折合为每毫升试样提取液中叶酸含量的偏差小于１０％，则可继续按式（１）、式（２）、式（３）进行结果计算，否则需重新取样测定。试样稀释液的叶酸浓度按式（１）计算。犮＝犮狓犞狓…………………………（１）　　式中：犮———试样稀释液中叶酸浓度，单位为纳克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；犮狓———从标准曲线上查得试样系列管中叶酸含量，单位为纳克（ｎｇ）；犞狓———制备试样系列管时吸取的试样稀释液体积，单位为毫升（ｍＬ）。　　注：微孔板法吸取１００μＬ、２００μＬ和３００μＬ时，对应犞狓分别为１ｍＬ、２ｍＬ和３ｍＬ。采用直接提取法的试样叶酸含量按式（２）计算。犡＝犮×犞×犳犿×１００１０００…………………………（２）　　式中：犡　———试样中叶酸含量，单位为微克每百克（μｇ／１００ｇ）；犮———试样稀释液叶酸浓度平均值，单位为纳克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；犞———试样提取液定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犳———试样提取液稀释倍数；犿———试样质量，单位为克（ｇ）；１００１０００———由纳克每克（ｎｇ／ｇ）换算为微克每百克（μｇ／１００ｇ）的系数。犌犅５００９．２１１—２０２２６