SNT 5393-2022 山茶根结线虫检疫鉴定方法

ICS65.020.20CCSB16中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5393—2022山茶根结线虫检疫鉴定方法DetectionandidentificationofMeloidogynecamelliaeGolden19782022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2022*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023)编辑部:[phone]-7530中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张1.25字数38千字2023年1月第一版2023年1月第一次印刷印数1—500*书号:155175·708定价21.00元学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:宁波检验检疫科学技术研究院、中华人民共和国宁波海关技术中心、宁波中盛产品检测有限公司。本文件主要起草人:顾建锋、方亦午、刘乐乐、陈先锋。ⅠSN/T5393—2022学兔兔范围本文件规定了山茶根结线虫的检疫鉴定方法。本文件适用于进出境种苗、土壤、介质及植物产品中山茶根结线虫的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T24829毛刺线虫属(传毒种类)检疫鉴定方法SN/T1157进出境植物苗木检疫规程SN/T2117伪哥伦比亚根结线虫检疫鉴定方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4山茶根结线虫基本信息学名:MeloidogynecamelliaeGolden1978。英文名:Camelliaeroot-knotnematode。分类地位:线虫门(Nematoda),色矛纲(Chromadorea),小杆目(Rhabditida),垫刃亚目(Tylenchi-na),垫刃总科(Tylenchoidea),根结科(Meloidogynidae),根结亚科(Meloidogyninae),根结线虫属(Meloidogyne)。山茶根结线虫其他相关信息见附录A。5方法原理根结线虫二龄幼虫入侵寄主根部后固着寄生,逐渐发育为卵圆形或梨形雌虫,导致寄主根部膨大呈根瘤状。但有时山茶根结线虫等种类雌虫露出根外(见附录B)。如发现疑似根结,可直接剖检寻找雌虫,也可从寄主植物根系及根围土壤或介质中分离获得二龄幼虫或雄虫。获得线虫后,可进一步用形态学、分子生物学或者上述方法相结合,并参考其寄主、地理分布等信息(见附录A),进行种类鉴定。6器材和试剂6.1仪器设备和器具PCR仪、冷藏箱、体视显微镜、生物显微镜、超低温冰箱、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、高压灭菌1SN/T5393—2022学兔兔标准下载锅、微波炉、烘箱;改良线虫分离漏斗、医用解剖刀、载玻片、盖玻片、酒精灯、线虫挑针、PCR管、24孔细胞培养板、可调式微量移液器(2μL~1000μL)及相应的吸头。6.2主要试剂除特别规定外,所有实验用试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定。甲醛、乙醇、甘油、蜡块、指甲油、液氮、2×TaqMasterMix预混液、10×PCR缓冲液(Mg2+free)、蛋白酶K(20mg/mL)、限制性内切酶HinfI、ddH2O、100bpMarker、GelRed染料、50×TAE溶液、琼脂糖凝胶。7现场检疫与取样7.1症状检查现场检疫时应检查植株生长是否健康,挖取寄主植物根部,观察根上是否有根结或根瘤状畸形,或生长不良、腐烂、变色、畸形等症状。7.2取样按照SN/T1157进行抽样和取样,对有根结等症状的重点取样。如无症状,则随机取样。对于进境苗木,如样品数量不大于5株(份),要求对每株单独取1份样品。每份样品质量不小于500g,取样深度为土表下20cm左右(采样时应多带些根,以便进一步分离雌虫)。样品数量大于5株(份),要求至少取样5份。样品置密闭塑料袋中,标明品名、报检号、来源国、检测要求等信息,及时送实验室检测。如小苗带土较少,则尽量多取根和土样,不带土的苗应仔细检查根部。土壤、介质或其他植物产品可参照该方法。8实验室检验8.1线虫分离实验室接到样品后应立即进行线虫分离。若不能及时分离,可将样品暂时保存于4℃冷藏箱中。土壤、介质、根系等样品应用改良漏斗法分离线虫(按照GB/T24829),根结可直接剖检分离线虫(按照SN/T2117)。8.2体视显微镜镜检用改良漏斗法分离到的多数是根结线虫二龄幼虫,偶尔有雄虫。样品中根结线虫常与其他多种线虫混杂,须注意区分。根结线虫二龄幼虫较细小,体长多在300μm~500μm,行动缓慢,虫体一般内含物较多,颜色偏深。雄虫体长达1000μm~1500μm,行动缓慢。雌虫须剖开根结才能看到(但也有部分根结线虫不引起明显的结节,或根结部分露出根表面),呈球形或近梨形,长500μm~700μm,宽300μm~500μm,乳白色或近褐色。8.3标本制作若镜检发现疑似根结线虫二龄幼虫或雄虫,需制作临时玻片或永久玻片进一步观察(按照GB/T24829)。发现雌虫,须制作会阴花纹永久玻片(按照SN/T2117)。8.4生物显微镜观察、拍摄和测量仔细观察雌虫、雄虫和二龄幼虫主要鉴定特征并显微拍摄,主要鉴定特征包括雌虫会阴花纹形态,2SN/T5393—2022学兔兔标准下载雌虫、雄虫和二龄幼虫的头部和口针形态,背食道腺开口到口针基球的距离(dorsalglandorifice,DGO),二龄幼虫的体长、口针长度及基部球形态、尾形及透明区长度等特征。应在每张图片上加相应标尺,测量并计算:体长/虫体最宽处体宽(a)、体长/尾长(c)、尾长/肛门处虫体直径(c’)等值。如样品足够,应测量雄虫、二龄幼虫各20条以上。9形态学鉴定9.1二龄幼虫形态特征(见附录C)体长约500μm(440μm~570μm),头架骨化弱,唇区缢缩不明显。体表环纹显著,虫体后部变粗糙。侧线4条,约占体宽的1/4。口针纤细,基部球显著。中食道球卵圆形,瓣膜显著。尾圆锥形,肛门处体宽约10.8μm(9.6μm~12.7μm),尾长约47μm(40μm~56μm),尾部粗环纹一直延伸到近尾端,尾末端多数钝圆,偶尔钝尖,透明尾长1.4μm~6.6μm(测计值见表1)。表1山茶根结线虫二龄幼虫测计值及与原始文献比较表单位为微米形态指标山茶根结线虫(王江岭等,2013)山茶根结线虫(Golden,1978)n2570体长512±26.4(462~560)501±21(443~576)最大体宽17.1±1.5(15.4~21.3)—口针长11.6±0.5(10.7~12.3)11.6±0.2(11.2~12)DGO3.9±0.6(3.1~5.2)3.7±0.4(3~4.5)尾长46.1±4.1(40.4~55.4)47±3.1(40~56)肛门处体宽10.8±0.9(9.6~12.7)—透明尾长3.7±1.9(1.4~6.6)6.3±1.4(4~8.9)a30.1±2.9(22.6~33.8)26±1.8(21~30)c11.1±1.0(9.2~12.7)10.7±0.6(9.5~12)c'4.3±0.5(3.2~5.1)—3SN/T5393—2022学兔兔雌虫形态特征(见附录D)虫体梨形或球形,颈部明显。制片后观察,会阴花纹显著,呈星形,边缘常有角状突起,条纹多呈粗绳状。阴门与肛门凹陷,与会阴花纹不在同一平面上。9.3雄虫形态特征(见附录D)热杀死后虫体后端略腹弯。侧线4条。唇区略缢缩,头冠显著。口针粗壮,前端尖细,基部球圆。DGO4μm~7μm。单精巢,长约800μm。交合刺稍向腹弯,末端钝圆。9.4主要鉴定特征山茶根结线虫雌虫和二龄幼虫均较容易与其他种区分。其雌虫会阴花纹呈星形,花纹条纹呈粗绳状,边缘常有角状突起。二龄幼虫尾末端钝圆,尾部粗环纹一直延伸到近尾端,尾长40μm~56μm,肛门处体宽9.6μm~12.7μm,透明区较短(1.4μm~6.6μm)。9.5形态测计值二龄幼虫是检测过程中常见的虫态,而雌虫和雄虫的测量数据对种类鉴定的作用有限,因此本文件仅列出二龄幼虫的主要测计值。10分子生物学鉴定10.1特异PCR鉴定方法采用山茶根结线虫特异引物MCF/MCR,进行特异PCR扩增,并同时采用通用引物D2A/D3B扩增核糖体rRNA的28S基因片段,排除因引物等问题而导致未扩增出片段造成的假阴性问题。以山茶根结线虫作为阳性对照,以其他根结线虫样品作阴性对照,超纯水作空白对照。具体操作按照附录E。10.2mtDNAPCR-RFLP方法mtDNA的COII/lrRNA基因片段扩增引物C2F3/MRH106,以山茶根结线虫作为阳性对照,超纯水作空白对照,PCR扩增产物采用限制性内切酶HinfI进行酶切。具体操作按照附录F。10.3DNA条形码方法采用引物D2A/D3B扩增28SrRNA基因。扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测后,送到生物测序公司双向测序。获取的序列片段与NCBI中登录的山茶根结线虫和其他种类线虫的28S基因序列比对,通过序列相似性、系统进化分析等方法,确定是否为山茶根结线虫。具体操作步骤按照附录G。11结果判定已有多次截获经验的实验室,可单独采用形态学或分子生物学方法进行鉴定。若为实验室首次截获,或在新的来源国或寄主上发现,应将形态学方法与分子生物学方法相结合进行判定。以二龄幼虫、雄虫或雌虫会阴花纹的形态特征或者特异PCR、mtDNA-RFLP和DNA条形码等分子生物学方法作为该线虫的鉴定依据,结合寄主、地理分布等信息,符合第9章或第10章的可鉴定为山4SN/T5393—2022学兔兔标准下载茶根结线虫。12记录和标本样品保存若鉴定为山茶根结线虫,须将剩余的线虫杀死、固定后制成永久玻片保存;可用4%甲醛固定后于指形管中长期保存。应保存的记录信息包括样品编号、为害症状(包括相关照片)、被感染材料的状态和来源、经鉴定的有害生物学名、测计数据、显微照片、标本鉴定人、鉴定时间、制作人、制作时间等信息。对含有线虫的剩余样品,经登记后妥善保存。保存期至少为6个月,期满后视情况作销毁处理。5SN/T5393—2022学兔兔(资料性)山茶根结线虫相关信息A.1发现历史Golden于1965年在日本输往美国的山茶Camelliaejaponica根中发现,1978年由Golden描述为新种。2013年,意大利报道从来自日本的茶梅盆栽中截获该线虫。宁波口岸曾多次从来自日本的茶梅、罗汉松、紫薇等景观树中发现该线虫。A.2寄主山茶、茶梅和红淡比Cleyerajaponica、柃木Euryajaponica、滨柃E.emarginata、茶树Camelliasinensis、白三叶Trifoliumrepens、杨桐属Adinandraryukyuensis、小果核果茶Tutcheriavirgata、水蛇麻Fatouavillosa、酢浆草Oxaliscorniculata以及绛车轴草Trifoliumincarnatum和红车轴草T.pratense。宁波口岸曾在罗汉松、鸡爪槭、紫薇等景观树上截获山茶根结线虫。A.3地理分布日本。A.4危害对多种山茶科植物造成侵染,且分布较为广泛,可对寄