SNT 2617-2022 冬生疫霉病菌检疫鉴定方法

ICS65.020.20CCSB16中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2617—2022冬生疫霉病菌检疫鉴定方法DetectionandidentificationofPhytophthorahibernalisCarne2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国南宁海关、中华人民共和国天津海关。本文件主要起草人:吴品珊、雷荣、焦彬彬、闫正跃、罗加凤、杨翠云。ⅠSN/T2617—2022学兔兔的检疫鉴定方法。本文件适用于针对冬生疫霉寄主的植株和果实以及夹带土壤的检疫鉴定。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4病原菌基本信息学名:PhytophthorahibernalisCarne分类地位:真核生物域(EukaryotaDomain),菌藻界(Chromista),卵菌门(Oomycota),霜霉纲(Peronosporea),霜霉目(Peronosporales),霜霉科(Peronosporaceae),疫霉属(Phytophthora)。传播途径:主要通过感病寄主、土壤和水流传播扩散。短距离传播为孢子囊借助灌溉、溅射的水、风雨或蜗牛传播,贸易性调运寄主苗木、果实是病菌远距离传播的主要方式。寄主范围:主要为柑橘属植物,还可侵染杜鹃等植物。病菌的其他信息参见附录A。5方法原理依据病害症状、分离菌的形态特征和分子生物学特性,用常规PCR或荧光PCR特异性引物扩增冬生疫霉病菌的ITS(internaltranscribedspacer)基因,或用重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification,RPA)特异性引物扩增ras-relatedYptl基因,对冬生疫霉病菌进行综合检疫鉴定。6仪器和用具6.1仪器生物显微镜、体视显微镜、纯水仪、光照培养箱、高压灭菌锅、超净工作台、制冰机、PCR仪、实时荧光PCR仪、恒温扩增仪、凝胶成像系统、电泳仪、电子天平(感量0.01g)、冰箱。6.2用具烧杯、三角瓶、量筒、试管、培养皿、酒精灯、镊子、剪刀、解剖刀、载玻片、盖玻片、塑料研杵、移液器、移液器吸头、离心管、液氮罐、封口膜parafilm、基于链霉亲和素和荧光素的核酸检测试纸条。1SN/T2617—2022学兔兔试剂、材料和培养基7.1试剂琼脂粉、V8液、碳酸钙、葡萄糖、琼脂糖、次氯酸钠溶液、匹马霉素、氨苄青霉素钠盐、利福平钠盐、五氯硝基苯、Tween20、氯化钙、Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)缓冲液、氧化镁、280mmol/L醋酸镁溶液、TwistAmp􀆿nfo酶干粉、PBST(含0.1%Tween20的磷酸缓冲液)、盐酸、乙二胺四乙酸四钠盐(Na2EDTA)、十二烷基硫酸钠、氢氧化钠、醋酸钠、氯化钾、50×TAE(Tris-醋酸盐-EDTA)、无菌双蒸水、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液、Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、RNaseA、液氮、苯酚、三氧甲烷、蛋白酶K、TaqDNA聚合酶、TaqManPCRMasterMix、PCR反应缓冲液、核酸染料、dNTP、DNA分子质量标准物。7.2材料马铃薯、雪松松针、柑橘叶片、冬生疫霉病菌DNA。7.3培养基PARP-V8选择性培养基、V8培养基、马铃薯葡萄糖培养基具体配方参见附录B。8检疫鉴定方法8.1症状检查观察柑橘等寄主果实是否有变褐色,叶片和小枝是否枯萎;杜鹃属等寄主植物叶片、根茎是否有病斑;其他寄主上为根部腐烂或溃疡。症状图片见附录A。检查寄主是否携带土壤或介质,收集土壤或介质做诱集试验。8.2分离培养和诱集8.2.1分离培养将疑似症状的柑橘果实表皮、植物根茎叶等其他组织,用0.5%次氯酸钠消毒2min~5min,无菌水冲洗3次,灭菌滤纸吸干水分,放于PARP-V8选择性培养基或马铃薯葡萄糖培养基上。16℃~20℃黑暗培养4d~6d,如有真菌菌落出现,转到V8培养基上,16℃~20℃黑暗培养。8.2.2土壤和介质诱集称取25g土壤或介质,碾碎去杂放入灭菌烧杯中,加入无菌水将材料润湿,封口后置于16℃~20℃黑暗放置。3d~5d后在烧杯中加入灭菌水,使水层高4.0cm。取雪松松针或柑橘叶片,无菌水清洗后漂放在水面或浸在水中,16℃~20℃黑暗诱集。2d~3d后开始检查,取有失绿或变色的雪松松针或柑橘叶片,无菌水冲洗,灭菌滤纸吸干水分,放于PARP-V8选择性培养基或马铃薯葡萄糖培养基上,如有真菌菌落出现,转至V8培养基上16℃~20℃黑暗培养纯化。8.2.3孢子囊培养切取纯化菌落边缘菌丝块置于灭菌培养皿中,加无菌水至菌块表面有游离水,16℃~20℃黑暗培2SN/T2617—2022学兔兔标准下载养诱发孢子囊,1d~2d后观察孢子囊生成。8.2.4卵孢子培养将分离菌转到V8培养基上,在7℃~8℃黑暗培养4周~6周,观察是否有卵孢子形成。8.3分子生物学鉴定8.3.1DNA提取收集分离出的疑似真菌,放入1.5mL离心管中,浸在液氮里用塑料研杵碾碎,采用CTAB法或植物基因组提取试剂盒提取DNA。DNA提取方法按附录C执行。8.3.2常规PCR检测特异性引物PHIB1和PHIB2的序列分别为5'-TCGGGTCTGAGCTAGTAGTCTT-3'、5'-CTTC-CACAACCAATTCCATTATGC-3'。反应体系(25μL):样品DNA2μL,10×PCRbuffer2.5μL,2.5mmol/LMgCL22.5μL,2.5mmol/LdNTPs2.5μL,10μmol/L引物各0.5μL,5U/μlTaqDNApolymerase0.2μL,ddH2O14.3μL。反应条件:94℃2min;94℃30s、64℃30s、72℃60s,30个循环;72℃10min,4℃保存。以冬生疫霉病菌的DNA作为阳性对照,以无菌水作为空白对照,以健康寄主植物DNA作为阴性对照。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶(含荧光染料)、1×TAE缓冲液进行电泳分离,用凝胶成像系统分析。8.3.3实时荧光PCR检测特异性引物PH-F的序列为5'-CGACTTGCCACCGGGA-3'、PH-R的序列为5'-AACGGTACT-TCTCTTTGCTCGAA-3'、荧光探针PH-Pr的序列为5'-(FAM)TTCCACAACCAATTCCAT(NFQ-MGB)-3'。反应体系(25μL):样品DNA1μL,2×TaqManPCRMasterMix12.5μL,10μmol/L特异性引物各1μL,10μmol/L探针PH-Pr0.5μL,ddH2O9.0μL。反应条件:94℃10min;94℃15s、56℃60s,40个循环。以冬生疫霉病菌的DNA作为阳性对照,以无菌水作为空白对照,以健康寄主植物DNA作为阴性对照。8.3.4RPA试纸条法特异性正向引物PhRPA-F的序列为5'-TTCCACCCTTCCACCAGACTGCTGAGGAGG-3'、反向引物PhRPA-R的序列为5'-(Biotin)TGTTAGCTGCGTGTTCGTTGGTCACCCCAGA-3'、探针PhR-PA-P的序列为5'-(FAM)CTTCTGTGATTTATCCAGAAAATCCGTACGAT-THF-GAGCTG-GACGGCAAGA(C3space)-3'。反应体系(50μL):将29.5μL再水化缓冲液、11.2μL无菌水、2.1μL10μmol/L正向引物、2.1μL10μmol/L反向引物和0.6μL10μmol/L探针溶液混匀后,加入到TwistAmp􀆿nfo酶干粉中,充分溶解后,加入2μL样品DNA和2.5μL醋酸镁(280mmol/L),置于38℃,反应20min。以冬生疫霉病菌的DNA作为阳性对照,以无菌水作为空白对照,以健康寄主植物DNA作为阴性3SN/T2617—2022学兔兔标准下载对照。以上每个反应液,分别取10μL加入90μLPBST,充分混合后,取10μL加于图1所示的样品区,并将其竖直放入装有200μLPBST的1.5mL离心管中,观察检测线和控制线位置的显色情况。当控制线出现条带后,再放置2min,取出试纸条,立即观察,并拍照保存。图1试纸条9鉴定标准9.1菌落特征在马铃薯葡萄糖培养基上生长缓慢,20℃下生长速度为3.5mm/d~4mm/d。菌落白色,花瓣状,边缘不规则,菌丝紧贴培养基表面生长,气生菌丝较少。V8培养基上菌落无色,边缘规则,菌丝紧贴培养基表面生长,气生菌丝极少,20℃下生长速度为3mm/d~3.5mm/d。菌落图片见附录D。9.2病菌形态孢子囊长卵圆形或椭圆形,易脱落,顶部具有不完全的乳头状突起,靠近半乳突处最宽,基部锥形;孢子囊大小(29μm~53μm)×(14μm~22μm)[平均(40μm×19μm)],长宽比较大,为1.81~2.4,孢子柄长23μm~73μm;孢囊梗长23μm~73μm,不分枝或形成不规则合轴式长侧枝;孢子囊低温萌发释放游动孢子;该菌无菌丝膨大体和厚垣孢子。该病菌为同宗配合,藏卵器大小为22μm~56μm(平均35μm);雄器多围生,偶侧生,平均10μm×15μm;卵孢子大小为22μm~45.6μm(平均30μm),黄橙色,壁厚1μm~3μm,且卵孢子充满藏卵器。卵孢子不易培养,可不作为鉴定依据。孢子囊和卵孢子形态图见附录D。9.3与近似种的形态区别冬生疫霉病菌与丁香疫霉病菌(Phytophthorasyringae)在形态上近似,主要区别为冬生疫霉孢子囊易脱落,雄器多围生,无菌丝膨大体;丁香疫霉菌落孢子囊不易脱落,雄器多侧生,有菌丝膨大体。参见附录E。9.4PCR特异性产物在阳性对照和阴性对照结果均正常的情况下,特异性引物PHIB1和PHIB2的PCR扩增片段为407bp。4SN/T2617—2022学兔兔检测,在阳性对照和阴性对照结果均正常的情况下:———Ct值≤35,判定冬生疫霉病菌阳性;———Ct值≥40,判定冬生疫霉病菌阴性;———Ct值在35~40之间,要进行重复测试,如Ct值≤35,判定冬生疫霉病菌阳性,否则为阴性。9.6RPA试纸条检测在阳性对照和阴性对照结果均正常的情况下,如试纸条在控制线和检测线均有条带产生,判定检出冬生疫霉病菌。10结果判定病菌的培养性状和形态特征与9.1和9.2的描述一致,且常规PCR或实时荧光PCR检测或RPA试纸条检测为阳性,可判定为冬生疫霉病菌。流程参见附录F。11样品和档案保存11.1样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出冬生疫霉病菌的样品,应保存于10℃冰箱中,至少保存6个月以备复核。该类样品保存期满后,应经高压灭菌后方可处理。11.2菌株保存与处理从检测样品中分离并鉴定为冬生疫霉病菌的菌株,应妥善保存。将菌株接种于PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基的斜面上,20℃培养5d,10℃黑暗条件下保存。定期(60d)转接防止病菌失活,至少保存6个月,保存期满后高压灭菌灭活处理。11.3结果记录与资料保存完整的试验记录包括样品的来源、种类、时间,试验的时间、地点、方法和结果等,并应有实验人员和审核人员签字。5SN