SNT 5484-2022 罗非鱼湖病毒病检疫技术规范

ICS65.020.30CCSB41中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5484—2022罗非鱼湖病毒病检疫技术规范QuarantineprotocolfortheTilapialakevirusdisease2022-07-07发布2023-02-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔兔—2022*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023)编辑部:[phone]-7530网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张0.75字数22千字2023年1月第一版2023年1月第一次印刷印数1—500*书号:155175·898定价12.00元学兔兔—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:深圳市检验检疫科学研究院、深圳海关动植物检验检疫技术中心、佛山科学技术学院、茂名海关综合技术服务中心、深圳技术大学。本文件主要起草人:刘荭、郑晓聪、刘辉、曾伟伟、温智清、朱崧琪、王津津、刘莹、贾鹏。ⅠSN/T5484—2022学兔兔范围本文件规定了罗非鱼湖病毒的分离、实时荧光RT-PCR、套式RT-PCR的检测方法。本文件适用于罗非鱼湖病毒病的监测、检测与检疫。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文本中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样3术语、定义和缩略语本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件:BSA:Bovineserumalbumin牛血清白蛋白Ct:Cyclethreshold循环阈值CPE:Cytopathiceffect细胞病变效应DEPC:Diethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯dNTPs:Deoxynucleosidetriphosphates三磷酸脱氧核苷酸RNA:Ribonucleicacid脱氧核糖核酸RT-PCR:Reversetranscriptionpolymerasechainreaction逆转录聚合酶链式反应TiLV:Tilapialakevirus罗非鱼湖病毒(参见附录A)4试剂和材料4.1水:符合GB/T6682中二级水的规格。4.2DEPC水:配制方法见附录B.1或购买商品化试剂。4.3细胞培养液:见附录B.2。4.4细胞系:条纹鳢细胞系(E-11)。4.5HEPES:4-羟乙基哌嗪乙磺酸。4.6引物:用DEPC水将每条引物配制成100μmol/L储存液,置于-20℃以下冻存;使用时,取适量配制成20μmol/L工作液,避免多次冻融。具体序列如下:a)实时荧光RT-PCR引物与探针:TiLV-S3-F1:5’-CGAACTGTTGCCTTTGGAAATT-3’TiLV-S3-R1:5’-TGAAGAATAAGTGGATTGCCTTTG-3’TiLV-S3-P1:5’-FAM-CCGCGGCTGGCCTTCCAG-BHQ1-3’1SN/T5484—2022学兔兔。b)套式RT-PCR引物:TiLVF1:5’-TATGCAGTACTTTCCCTGCC-3’TiLVF2:5’-TATCACGTGCGTACTCGTTCAGT-3’TiLVR:5’-GTTGGGCACAAGGCATCCTA-3’TiLVF1和TiLVR扩增TiLVS3片段415bp片段;TiLVF2和TiLVR扩増TiLVS3片段250bp片段。5仪器和设备5.1倒置显微镜。5.2恒温培养箱。5.3荧光PCR仪。5.4PCR扩增仪。5.5凝胶成像仪。6临床症状患病鱼主要症状为昏睡、游动异常、食欲不振、体色发黑、体表充血糜烂、腹部肿胀、眼球凸出、鳃丝苍白等(参见附录A)。7病毒分离7.1采样采样数量按照GB/T18088的规定执行。体长≤4cm的鱼苗取整条;体长4cm~6cm的鱼苗取内脏(包括肾);体长6cm的鱼取肝、脑、肾和脾;成熟的雌鱼需取卵巢液;鱼卵直接使用。7.2样品处理应保持在10℃以下进行处理。样品匀浆,用含有1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的细胞培养液(见附录B.2)按1∶10稀释,混匀悬浮。于15℃下孵育2h~4h或4℃下孵育6h~24h。7000r/min,4℃离心15min,收集上清液。卵巢液用细胞培养液稀释两倍以上,用相同的方法离心并在以后的步骤中直接用其上清液。7.3病毒分离培养将1∶10稀释的组织匀浆上清液用细胞培养液再做两次10倍稀释,然后将1∶10、1∶100、1∶1000三个稀释度的上清液,用无菌操作方法,以适当的体积分别接种到生长约24h的E-11细胞单层中,每孔(2cm2)的细胞单层最多接种100μL。接种后的细胞板置于25℃±2℃培养7d。接种的细胞板需设2孔阳性对照(接种了TiLV的细胞)和2孔空白对照(未接种病毒的细胞)。阳性对照组和待测样品都接种细胞后,7d内每天用倒置显微镜检查。空白对照细胞应当正常,阳性对照应出现CPE,CPE表现为局部区域细胞开始裂解,周围细胞收缩变圆,逐渐发展,细胞最终全部脱落。如果接种样品的细胞在培养中出现CPE,立即进行鉴定。在培养7d后如无CPE出现应进行再传代培养。传代时,冻融并收集接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物,以7000r/min,4℃离心15min,收集上清液,将上清液接种到新鲜培养的E-11细胞单层,再培养7d,每天用倒置显微镜2SN/T5484—2022学兔兔标准下载检查。如果阳性对照未出现CPE,则应换用一批E-11细胞和一批新的组织样品重新按上述方法进行病毒分离。7.4结果判定在空白对照细胞正常,阳性对照细胞出现CPE的情况下,样品接种细胞并盲传后均无CPE出现,判为阴性;如果有CPE出现,应立即应用实时荧光RT-PCR、套式RT-PCR等方法进行鉴定。8实时荧光RT-PCR8.1设立对照每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照可用DEPC水代替样品;阴性对照为不含TiLV的组织或细胞培养物;阳性对照为含TiLV的阳性组织、细胞培养物或含目的片段的RNA。8.2RNA抽提分别取200μL待检样品组织上清液或待检样品细胞培养物,加入1mLTrizol试剂,用移液器充分吹打10次~20次,于室温下放置5min;加入200μL三氯甲烷,振荡混匀,于室温下放置15min;4℃12000r/min离心10min;取上层水相至一新的离心管中,加等体积异丙醇,上下颠倒数次混匀,于-20℃下放置20min;4℃12000r/min离心10min;弃上清液,沉淀用1mL75%乙醇清洗;4℃8000r/min离心10min,弃上清液,沉淀室温干燥5min;加20μLDEPC水溶解RNA沉淀。4℃冰箱保存备用,RNA溶液应避免反复冻融,并尽快用于检测。RNA提取也可采用等效的商品化RNA提取试剂盒。8.3反应体系在冰盒上配制25μL反应体系。在PCR反应管中加入:DEPC水14μL,10×一步法RT-PCR缓冲液(不含Mg2+)2.5μL,dNTPs(各10mmol/L)1μL,MgCl2(25mmol/L)2μL,引物TiLV-S3-F1(20μmol/L)0.5μL,引物TiLV-S3-R1(20μmol/L)0.5μL,探针TiLV-S3-P1(20μmol/L)0.5μL,RNA酶抑制剂(40U/μL)0.5μL,AMV逆转录酶(5U/μL)0.5μL,TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL,样品RNA或对照2.5μL,混匀。可采用同等扩增效率的商品化荧光RT-PCR试剂盒。8.4反应条件将已加样的PCR反应管短暂离心后放入荧光PCR仪,扩增反应条件设定:50℃反转录15min,94℃预变性2min;94℃变性5s,58℃退火35s,40个循环;在58℃阶段设置采集荧光。反应参数可根据反应体系和不同品牌PCR仪做适当调整。8.5分析条件设定以综合分析仪器给出的各项结果、基线以及仪器给出的默认值作为参考,阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为原则,具体还需根据仪器噪音情况进行调整;选择FAM通道进行分析。8.6结果判定阳性对照Ct值≤35,有典型的扩增曲线,阴性对照和空白对照无Ct值,无扩增曲线,结果成立。3SN/T5484—2022学兔兔值≤35,且扩增曲线出现明显对数增长期为阳性。待测样品无Ct值、无扩增曲线或者反应曲线无明显对数增长期为阴性。对于35Ct值40.0的样品,重新取样进行检测。重复检测样品Ct值40且扩增曲线有明显的对数增长期,判定为荧光RT-PCR结果阳性,否则判定为阴性。9套式RT-PCR9.1设立对照每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照可用DEPC水代替样品;阴性对照为不含TiLV的组织或细胞培养物;阳性对照为含TiLV的阳性组织、细胞培养物或含目的片段的RNA。9.2RNA抽提同8.2。9.3RT-PCR扩增在冰盒上配制25μLRT-PCR反应体系。在PCR反应管中加入:DEPC水14.5μL,10×一步法RT-PCR缓冲液(不含Mg2+)2.5μL,dNTPs(各10mmol/L)1μL,MgCl2(25mmol/L)2μL,引物TiLVF1(20μmol/L)0.5μL,引物TiLVR(20μmol/L)0.5μL,RNA酶抑制剂(40U/μL)0.5μL,AMV逆转录酶(5U/μL)0.5μL,TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL,样品RNA或对照2.5μL,混匀。置于PCR仪中。按以下程序进行RT-PCR扩增:50℃30min,94℃2min;94℃30s,55℃30s,72℃30s,35个循环;72℃10min,4℃保存。可采用同等扩增效率的商品化RT-PCR试剂盒。9.4套式PCR扩增在冰盒上配制50μLPCR反应体系。在PCR反应管中加入:水32μL,10×TaqDNA聚合酶缓冲液(不含Mg2+)5μL,dNTPs(各10mmol/L)1μL,MgCl2(25mmol/L)4μL,引物TiLVF2(20μmol/L)1μL,引物TiLVR(20μmol/L)1μL,TaqDNA聚合酶(5U/μL)1μL,第一轮RT-PCR产物5μL。混匀,置于PCR仪中。按以下程序进行第二轮PCR扩增:94℃2min;94℃30s,55℃30s,72℃30s,35个循环;72℃10min,4℃保存。可采用同等扩增效率的商品化PCR试剂盒。9.5电泳检测用新鲜配制的1×TAE电泳缓冲液配制1.5%琼脂糖凝胶,加入适量的电泳核酸染料。取适量扩增产物液进行电泳检测,设DNAMarker同步电泳;采用5V/cm~8V/cm,电泳0.5h~1h,用凝胶成像仪或紫外透射仪观察,拍照记录检测结果。9.6结果判定阴性对照和空白对照在套式RT-PCR两轮扩增中均未扩增出目的片段,阳性对照第一步扩增出现415bp、第二步扩增出现250bp片段的情况下,实验有效。若待测样品电泳,第一步扩增出现415bp或第二步扩增出现250bp大小条带,取PCR扩增产物进行测序,同参考序列(参见附录C.2)进行比较,相似度达到95%以上,判定为阳性。若待测样品无扩增或扩增