农业农村部公告第600号 动物毛发中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和苯乙醇胺A的测定 液相色谱–串联

中华人民共和国农业农村部公告第600号根据《兽药管理条例》《饲料和饲料添加剂管理条例》规定,我部组织制定了《动物毛发中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和苯乙醇胺A的测定液相色谱–串联质谱法》检测方法,现予发布,自发布之日起实施。特此公告。附件:动物毛发中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和苯乙醇胺A的测定液相色谱–串联质谱法农业农村部2022年9月3日—1—附件动物毛发中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和苯乙醇胺A的测定液相色谱–串联质谱法1范围本方法规定了动物毛发中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和苯乙醇胺A残留的液相色谱–串联质谱测定方法。本方法适用于猪、牛和羊的毛发中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和苯乙醇胺A残留量的测定。2原理动物毛发经清洗、烘干、粉碎处理后，经盐酸溶液水解，固相萃取柱净化，液相色谱–串联质谱仪测定，同位素内标法定量。3试剂和材料以下所用试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水为符合《分析实验室用水规格和试验方法》（GB/T6682）规定的一级水。3.1试剂3.1.1乙腈（C2H3N）：色谱纯。3.1.2甲酸（CH2O2）：色谱纯。3.1.3甲醇（CH4O）：色谱纯。—2—3.1.4十二烷基磺酸钠（C12H25SO3Na）。3.1.5盐酸（HCl）：含量36%~38%。3.1.6氨水（NH3•H2O）：含量25%~28%。3.2溶液配制3.2.1十二烷基磺酸钠溶液：称取十二烷基磺酸钠10g，加水溶解并稀释至1000mL，混匀。3.2.20.1mol/L盐酸溶液：量取盐酸8.3mL，加水稀释至1000mL，混匀。3.2.30.1%甲酸溶液：量取甲酸1mL，加水稀释至1000mL，混匀。3.2.40.1%甲酸乙腈溶液：量取乙腈10mL，加入0.1%甲酸溶液90mL，混匀。3.2.55%氨水甲醇溶液：量取氨水5mL，加入甲醇95mL，混匀。3.3标准品3.3.1盐酸克仑特罗、盐酸莱克多巴胺、沙丁胺醇和苯乙醇胺A，纯度均≥98.0%。详见附录1。3.3.2克仑特罗–D9、盐酸莱克多巴胺–D3、沙丁胺醇-D3和苯乙醇胺A–D3，纯度均≥98.0%。详见附录1。3.4标准溶液的制备3.4.1克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和苯乙醇胺A标准储备溶液（1mg/mL）：取约10mg标准品（以克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和苯乙醇胺A计），精密称定，分别置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成—3—浓度均为1mg/mL的标准储备溶液。–18℃以下保存，有效期12个月。3.4.2内标储备溶液（1mg/mL）：取约10mg标准品（以克仑特罗–D9、莱克多巴胺–D3、沙丁胺醇–D3和苯乙醇胺A–D3计），精密称定，分别置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成浓度均为1mg/mL的内标储备溶液。–18℃以下保存，有效期12个月。3.4.3混合标准中间溶液（10µg/mL）：分别吸取标准储备溶液0.10mL，置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成浓度为10µg/mL混合标准中间溶液。–18℃以下保存，有效期12个月。3.4.4混合标准工作溶液（100ng/mL）：吸取混合标准中间液0.10mL，置于10mL棕色容量瓶中，用0.1%甲酸乙腈溶液溶解并稀释至刻度，配成浓度为100ng/mL混合标准工作溶液，现配现用。3.4.5混合内标中间溶液（10µg/mL）：分别吸取内标储备液0.10mL，置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成浓度为10µg/mL混合内标中间溶液。–18℃以下保存，有效期12个月。3.4.6混合内标工作溶液（100ng/mL）：吸取混合内标中间液0.10mL，置于10mL棕色容量瓶中，用0.1%甲酸乙腈溶液溶解并稀释至刻度，配成浓度为100ng/mL混合内标工作溶液，现配现用。3.5材料—4—3.5.1固相萃取柱：混合型阳离子交换柱，60mg/3mL，或性能相当者。3.5.2微孔滤膜：孔径0.22μm，疏水型。4仪器和设备4.1液相色谱–串联质谱仪：配有电喷雾电离源（ESI）。4.2分析天平：感量0.00001g和0.001g。4.3超声波清洗器。4.4电热干燥箱，控温精度±2℃。4.5球磨机：振动频率不低于60Hz。4.6干燥器。4.7旋涡振荡器。4.8恒温水浴：控温精度±1℃。4.9离心机：转速不低于7000r/min。4.10氮吹仪。4.11固相萃取装置。5试料的制备与保存5.1样品采集选取动物背部毛发，从根部剪断，保存备用。采集毛发的质量应不少于4g。5.2样品制备取2g毛发加入50mL烧杯中，加入20mL十二烷基磺酸钠溶液，于超声波清洗器上超声清洗30min，再用水洗净毛发，置于40℃电热干燥箱中烘干，用球磨机将其均质成粉末。——取均质的供试毛发样品，作为供试试料。—5———取均质的空白毛发样品，作为空白试料。——取均质的空白毛发样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。5.3试料的保存置于干燥器中保存。6测定步骤6.1提取称取试料0.5g（精确至0.001g），于10mL离心管中，依次加入混合内标工作溶液25μL、0.1mol/L盐酸溶液5mL，涡旋混匀。于60℃水浴中水解4h，7000r/min离心10min，取上清液备用。6.2净化固相萃取柱依次用甲醇3mL，水3mL预洗。取全部备用液过柱，依次用水3mL、甲醇3mL淋洗，抽干，用5%氨水甲醇溶液3mL洗脱，收集洗脱液，于50℃氮气吹干，用0.1%甲酸乙腈溶液0.50mL溶解，过0.22μm微孔滤膜，供液相色谱–串联质谱仪测定。6.3标准曲线的制备精密量取混合标准工作溶液、混合内标工作溶液适量，用0.1%甲酸乙腈溶液稀释成浓度为0.50ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL和100ng/mL的系列标准工作溶液（含内标溶液均为5ng/mL），供液相色谱–串联质谱仪测定。以待测分析物特征离子质量色谱峰的峰面积与内标物特征离子质量色谱峰的峰面积比值为纵坐标，相应的—6—浓度为横坐标，绘制标准曲线；求回归方程和相关系数，相关系数应大于0.99。6.4测定6.4.1液相色谱参考条件a）色谱柱：C18柱，柱长100mm，内径2.1mm，粒径1.7μm。或性能相当者。b）柱温：40℃。c）进样量：10μL。d）流动相：A：0.1%甲酸溶液；B：乙腈，梯度洗脱程序见表1。表1梯度洗脱程序时间（min）流速（mL/min）A（%）B（%）00.398220.398270.3406080.3982100.39826.4.2串联质谱参考条件a）电离方式：电喷雾电离，正离子模式（ESI+）。b）检测方式：多反应监测（MRM）。c）离子源温度：500℃。d）离子化电压：4500V。e）脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量使质谱灵敏度达到检测要—7—求；脱溶剂气、锥孔气、碰撞气参考值分别为500L/h、30L/h和20L/h。f）定性离子对、定量离子对、锥孔电压及碰撞能量的参考值见表2。表2定性离子对、定量离子对、锥孔电压及碰撞能量的参考值被测物名称定性离子对（m/z）定量离子对（m/z）锥孔电压（V）碰撞能量（eV）克仑特罗277.0203.1277.0203.12517277.0259.211莱克多巴胺302.1107.0302.1164.12017302.1164.113沙丁胺醇240.1148.1240.1148.12520240.1222.110苯乙醇胺A345.0327.0345.0150.02217345.0150.013克仑特罗–D9286.0204.1286.0204.12517莱克多巴胺–D3305.2167.2305.2167.22014沙丁胺醇–D3243.0151.2243.0151.22514苯乙醇胺A–D3348.2153.1348.2153.222176.4.3测定方法a）定性测定在相同的测试条件下，试样溶液的保留时间与标准溶液保留时间的偏差应在±2.5%之内；试样溶液中的离子相对丰度与标准溶液中的离子相对丰度相比，符合表3的要求。表3试样溶液中离子相对丰度的允许偏差范围相对离子丰度50%20%至50%10%至20%≤10%允许的相对偏差±20%±25%±30%±50%—8—b）定量测定取试样溶液和标准工作溶液，作单点或多点校准，按内标法定量。标准工作溶液及试样溶液中目标物的响应值均应在线性范围内。如超出线性范围、应将试样溶液重新稀释至适当的浓度。在上述液相色谱–串联质谱条件下，标准溶液及对应的同位素内标溶液特征离子质量色谱图见附录2。6.5空白试验取空白试料，除不添加待测分析物外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。7结果计算和表述试料中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇或苯乙醇胺A残留量按标准曲线或以下公式计算：10001000mCAAVCCAAXiSSiSiSSiS式中：X—供试试料中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇或苯乙醇胺A残留量，单位为微克每千克（µg/kg）；A—试样溶液中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇或苯乙醇胺A的峰面积；SA—标准溶液中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇或苯乙醇胺A的峰面积；iSA—试样溶液中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇或苯乙醇胺A对应内标的峰面积；—9—iSA—标准溶液中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇或苯乙醇胺A对应内标的峰面积；Cs—标准溶液中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇或苯乙醇胺A浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；CiS—试样溶液中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇或苯乙醇胺A内标浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；iSC—标准溶液中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇或苯乙醇胺A内标浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V—溶解最终残余物体积，单位为毫升（mL）；m—供试试料的质量，单位为克（g）。注：测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。8方法的灵敏度、准确度和精密度8.1灵敏度本方法对猪、牛和羊毛发中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和苯乙醇胺A的检测限为0.5μg/kg，定量限为1μg/kg。8.2准确度本方法对于猪、牛和羊的毛发中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和苯乙醇胺A在1µg/kg~100µg/kg添加浓度范围内的回收率为70%~120%。8.3精密度本方法批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。—10—附录1标准品的中英文名称、化学分子式和CAS号标准品的中英文名称、化学分子式和CAS号见表4。表4标准品中英文名称、化学分子式和CAS号中文名称英文名称化学分子式CAS号盐酸克仑特罗ClenbuterolhydrochlorideC12H18ClN2O•HCl21898-19-1盐酸莱克多巴胺RactopaminehydrochlorideC18H23NO3•HCl90274-24-1沙丁胺醇SalbutamolC13H21NO318559-94-9苯乙醇胺APhenylethanolamineAC19H24N2O41346746-81-3克仑特罗–D9Clenbuterol-D9C12H9Cl2D9N2O129138-58-5盐酸莱克多巴胺–D3Ractopamine-D3hydrochlorideC18H20D3NO3•HCl1219794-72-5沙丁胺醇–D3Salbutamol-D3C13H18D3NO31219798-60-3苯乙醇胺A–D3PhenylethanolamineA-D3C19H21D3N2O4/—11—附录2克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和苯乙醇胺A的特征离子质量色谱图克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和苯乙醇胺A标准溶液（10ng/mL）及内标溶液（5ng/mL）的特征离子质量色谱图见图1。图1克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和苯乙醇胺A标准溶液及内标溶液的特征离子质量色谱图—12—