农业农村部公告 第350号3 庆大霉素残留检测方法标准(试行)

庆大霉素残留检测方法标准（试行）鸡可食性组织中庆大霉素残留检测方法液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法1范围本标准规定了鸡肝脏、肾脏、脂肪组织中庆大霉素残留检测的制样和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定方法。本标准适用于鸡肝脏、肾脏、脂肪组织中庆大霉素的残留量测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规则和试验方法3原理试料中的庆大霉素用磷酸盐缓冲溶液提取，阳离子固相萃取柱净化，氨化甲醇溶液洗脱，氮气吹至近干。用液相色谱-串联质谱仪测定，基质匹配标准曲线校准，外标法定量。4试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1庆大霉素（Gentamicin）标准品：纯度≥94%，德国Dr.EhrenstorferGmbH公司。其中C1组分含量为31.0%，C1a组分含量为22.2%，C2+C2a组分含量为46.8%。4.3乙腈：色谱纯。4.4甲醇：色谱纯。4.5三氯乙酸。4.6乙二胺四乙酸二钠。4.7磷酸二氢钾。4.8阳离子固相萃取柱：规格为60mg，3mL，或相当者。4.9氨化甲醇溶液：量取浓氨水15mL，用甲醇稀释至100mL。4.100.3%醋酸溶液：量取醋酸0.3mL，用水稀释至100mL。4.11磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钾1.36g，用980mL水溶解，分别加入乙二胺四乙酸二钠0.15g和三氯乙酸20g，溶解混匀并稀释至1000mL，置4℃保存，有效期1个月。4.122mol/L乙酸铵溶液：称取15.416g乙酸铵，用水溶解并稀释至100mL。4.13流动相A（乙酸铵缓冲液）：取2mol/L乙酸铵溶液25mL，浓氨水20mL，甲酸2mL，用水定容至1000mL。4.14庆大霉素贮备液：取庆大霉素标准品约10mg，精密称定，用水溶解并稀释成庆大霉素总组分为1mg/mL的贮备液，其中庆大霉素C1组分浓度为0.31mg/mL，庆大霉素C1a组分浓度为0.222mg/mL，庆大霉素C2+C2a组分浓度为0.468mg/mL。置20℃避光保存，现配现用。4.15庆大霉素标准工作液：准确量取庆大霉素贮备液适量，用0.3%醋酸溶液稀释，制成庆大霉素总组分浓度为100、250、500、1000、2000、5000ng/mL的系列标准工作液，各组分对应浓度庆大霉素C1组分为31.0、77.5、155、310、620、1550ng/mL；庆大霉素C1a组分浓度为22.2、55.5、110、222、444、1110ng/mL；庆大霉素C2+C2a组分为46.8、117、234、468、936、2340ng/mL。置4℃冰箱中避光保存，现配现用。5仪器和设备5.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI），或相当者。5.2天平：感量0.01g。5.3分析天平：感量0.00001g。5.4漩涡混合仪5.5组织匀浆机5.6高速冷冻离心机：转速不低于10000r/min。5.7固相萃取装置5.8氮吹仪5.9微孔滤膜：0.22µm。5.10塑料进样小瓶：250µL。5.11超声波仪6试样的制备与保存6.1试样的制备取新鲜或冷冻空白或供试组织，绞碎，并使均质。——取均质后的供试样品，作为供试试样。——取均质后的空白样品，作为空白试样。——取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。6.2样品的保存-20℃以下冰箱中贮存备用。7测定步骤7.1提取称取试样2g±0.02g，置50mL离心管中，加磷酸盐缓冲液10mL，涡漩混匀1min，超声5min，10000r/min离心10min。取上清液于另一50mL离心管中。残渣加磷酸盐缓冲液4mL，重复提取一次，合并两次提取液并稀释至15mL，涡旋混匀，作为备用液。7.2净化阳离子固相萃取柱依次用甲醇5mL和水5mL活化，取备用液7.5mL上样，依次用水5mL和甲醇5mL淋洗，抽干，用氨化甲醇溶液5mL洗脱，收集洗脱液于10mL塑料离心管中，于40℃下用氮气吹至近干，用0.3%醋酸溶液溶解并稀释至1mL，涡旋，用0.22µm滤膜过滤，滤液装塑料进样小瓶，供液相色谱-串联质谱仪测定。7.3基质匹配标准曲线的制备取空白样品，按“7.1”和“7.2”处理样品，获得试样基质空白溶液，分别精密量取相应庆大霉素标准工作液100μL，加入900μL空白基质中，制得庆大霉素总组分浓度10、25、50、100、200、500ng/mL（其中庆大霉素C1组分为3.1、7.75、15.5、31.0、62.0、155ng/mL；庆大霉素C1a组分为2.22、5.55、11.0、22.2、44.4、111ng/mL；庆大霉素C2+C2a组分为4.68、11.7、23.4、46.8、93.6、234ng/mL）的系列基质匹配标准工作溶液。供液相色谱-串联质谱仪测定。以各组分特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，各组分标准溶液浓度为横坐标，绘制基质单组分匹配标准曲线。求各组分回归方程和相关系数。7.4测定7.4.1色谱条件色谱仪：Agilent1290lnfinityII或相当者。色谱柱：AgilentPoroshellHPH-C8（3.0mm×100mm，2.7µm），或相当者。柱温：35℃流速：0.4mL/min。进样量：5µL。流动相：A相：乙酸铵缓冲液；B相：乙腈。线性梯度洗脱程序如表1所示。表1线性梯度洗脱程序时间（min）A（%）B（%）0.092.08.03.092.08.06.060.040.06.12.098.08.02.098.08.192.08.07.4.2质谱条件质谱仪：Agilent6470三重四级杆LC-MS/MS或相当者。离子源：ESI+。扫描方式：正离子扫描。检测方式：多反应检测。干燥气温度：250℃。干燥气流速：7L/min。雾化器：40psi。鞘气流速：12L/min。鞘气温度：350℃。毛细管电压：3500V。定性、定量离子对和裂解电压及碰撞能量见表2。表2庆大霉素定性、定量离子对和裂解电压及碰撞能量目标物前级离子子离子裂解电压（V）碰撞能量（eV）庆大霉素C1a450.2322.19012159.99024庆大霉素C2464.2322.110012160.110020庆大霉素C2a464.2322.19512160.19520庆大霉素C1478.2322.110512160.1105247.4.3定性测定通过样品各组分色谱图的保留时间与标准品各组分的保留时间、样品各组分色谱峰的特征离子与相应浓度标准品各组分色谱峰的特征离子相对照定性。样品各组分与标准品各组分的保留时间的相对偏差不大于2.5%；样品各组分特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液各组分的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断样品中存在相应的被测物。表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度50%20%至50%10%至20%≤10%允许的相对偏差±20%±25%±30%±50%7.4.4定量测定取空白样品溶液与相应的标准工作液，配制基质标准曲线，各组分分别做单点或多点校准，按外标法计算试样中庆大霉素每个组分的残留量，然后将各组分残留量相加即得到庆大霉素总组分的残留量。实测试样采用多点校正的方式定量；对于超过标准曲线最高点浓度的样品，以及方法学验证时的添加回收样品，采用单点校正的方式定量。相关图谱见附录A。7.5空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。8结果计算和表述8.1标准曲线校准将标准曲线每个组分的浓度和对应峰面积进行回归分析，然后按下式分别计算供试组织中庆大霉素各组分的残留量XC1、XC1a、XC2+C2a，再将各组分残留量相加即得到庆大霉素总组分残留量。X总（μg/kg）=XC1+XC1a+XC2+C2a式中:X——供试试样中被测单组分残留量（μg/kg），分别用XC1、XC1a、XC2+C2a表示；A——供试试样处理后试样溶液中庆大霉素相应单组分的色谱峰面积；b——标准曲线回归方程中截距；a——标准曲线回归方程中斜率；m——试样的质量（g）；V1——备用液的总体积（mL）；V2——过柱上样液的体积（mL）；V3——残余物定容的体积（mL）；X总——被测试样中庆大霉素总组分的残留量（μg/kg）。8.2单点校准按下式计算供试组织中庆大霉素单组分残留量XC1、XC1a、XC2+C2a，再将各组分残留量相加即得到庆大霉素总组分残留量。X总（μg/kg）=XC1+XC1a+XC2+C2a式中：X——试料中被测庆大霉素单组分的残留量（μg/kg），分别用XC1、XC1a、XC2+C2a表示；CS——对照溶液中相应庆大霉素单组分的浓度（ng/mL）；A——试样溶液中相应庆大霉素组分的色谱峰面积；AS——对照溶液中相应庆大霉素组分的色谱峰面积；m——试样的质量（g）；V1——备用液的总体积（mL）；V2——过柱上样液的体积（mL）；231VmaVVbAX231VmAVVACXSSV3——残余物定容的体积（mL）；X总——被测试样中庆大霉素总组分的残留量（μg/kg）。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。9检测方法灵敏度、准确度、精密度9.1灵敏度本方法在鸡肝脏、鸡肾脏和鸡脂肪的定量限（S/N10）为25µg/kg，庆大霉素各组分C1、C1a、C2+C2a在鸡肝脏、鸡肾脏和鸡脂肪的定量限分别为7.75µg/kg、5.55µg/kg、11.7µg/kg；检测限（S/N3）为10µg/kg，庆大霉素各组分C1、C1a、C2+C2a在鸡肝脏、鸡肾脏和鸡脂肪的检测限分别为3.1µg/kg、2.22µg/kg、4.68µg/kg。9.2准确度本方法鸡肝脏、鸡肾脏、鸡脂肪在总组分为25、50、100、200µg/kg添加浓度水平下（其中庆大霉素C1：7.75、15.5、31、62µg/kg；庆大霉素C1a：5.55、11.1、22.2、44.4µg/kg；庆大霉素C2+C2a：11.7、23.4、46.8、93.6µg/kg），庆大霉素总组分及各组分的平均回收率范围为60.38%～112.65%。9.3精密度本方法鸡肝脏、鸡肾脏、鸡脂肪在总组分为25、50、100、200µg/kg添加浓度水平下（其中庆大霉素C1：7.75、15.5、31、62µg/kg；庆大霉素C1a：5.55、11.1、22.2、44.4µg/kg；庆大霉素C2+C2a：11.7、23.4、46.8、93.6µg/kg），批内变异系数RSD≤10.92%；批间变异系数RSD≤12.52%。附录A（资料性附录）特征离子质量色谱图图A.1庆大霉素标准品溶液特征离子色谱图（100ng/mL）图A.2鸡肾脏空白样品特征离子色谱图图A.3鸡肾脏基质匹配标准溶液特征离子色谱图（25ng/mL）图A.4鸡肾脏添加样品特征离子色谱图（25ng/mL）图A.5鸡肝脏空白样品特征离子色谱图图A.6鸡肝脏基质匹配标准溶液特征离子色谱图（25ng/mL）图A.7鸡肝脏添加样品特征离子色谱图（25ng/mL）图A.8鸡脂肪空白样品特征离子色谱图图A.9鸡脂肪基质匹配标准溶液特征离子色谱图（25ng/mL）图A.10鸡脂肪添加样品特征离子色谱图（25ng/mL）