农业农村部公告第628号-10-2022 转基因植物及其产品成分检测 油菜常见转基因成分筛查

20221219发布－－20230301－－实施转基因植物及其产品成分检测油菜常见转基因成分筛查04中华人民共和国国家标准备案号：XXXX-XXXXＩＣＳ65.020.01BDetectionofgeneticallymodifiedplantsandderivedproducts—Screeningofcommongeneticallymodifiedcomponentsinrapeseed中华人民共和国农业农村部发布农业农村部公告第628号—10—2022CCS农业农村部公告第６２８号—１０—２０２２前　　言本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由中华人民共和国农业农村部提出.本文件由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口.本文件起草单位:农业农村部科技发展中心、中国农业科学院油料作物研究所.本文件主要起草人:武玉花、张秀杰、吴刚、陈子言、李俊、高鸿飞、李允静、肖芳、翟杉杉.Ⅰ农业农村部公告第６２８号—１０—２０２２转基因植物及其产品成分检测油菜常见转基因成分筛查１　范围本文件规定了油菜中常见转基因成分的定性筛查方法.本文件适用于１１种转基因油菜转化体(见附录A)及其加工产品中常见转基因成分(CaMV３５S启动子、FMV３５S启动子、NOS终止子、mCP４Ｇepsps基因、pat基因和bar基因)的定性筛查.２　规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.农业部１４８５号公告—４—２０１０　转基因植物及其产品成分检测　DNA提取和纯化农业部２０３１号公告—１９—２０１３　转基因植物及其产品成分检测　抽样NY/T６７２　转基因植物及其产品检测　通用要求３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件.３􀆰１CruA基因　cruciferinAgene编码储藏蛋白芸薹素基因,在本文件中作为油菜内标准基因.３􀆰２CaMV３５S启动子　３５Spromoterfromcauliflowermosaicvirus来自花椰菜花叶病毒(cauliflowermosaicvirus,CaMV)的３５S启动子.３􀆰３FMV３５S启动子　３５Spromoterfromfigwortmosaicvirus来自玄参花叶病毒(figwortmosaicvirus,FMV)的３５S启动子.３􀆰４NOS终止子　terminatorofnopalinesynthasegene来自胭脂碱合成酶(nopalinesynthase)基因的终止子.３􀆰５mCP４Ｇepsps基因　modified５ＧenolpyruvylshikimateＧ３Ｇphosphatesynthasegene来源于土壤农杆菌CP４株系,对核苷酸序列进行了偏好密码子修饰,编码５Ｇ烯醇式丙酮酸莽草酸Ｇ３Ｇ磷酸合成酶(５ＧenolpyruvylshikimateＧ３Ｇphosphatesynthasegene).３􀆰６bar基因　bialaphosresistancegene来源于土壤吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus),编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricinacetyltransferase,PAT).３􀆰７pat基因　phosphinothricinacetyltransferasegene来源于绿产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes),编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothriＧ１农业农村部公告第６２８号—１０—２０２２cinacetyltransferase,PAT).４　原理依据１１种转基因油菜转化体中常见的６种调控元件和基因序列,设计特异性引物及探针,对试样进行PCR扩增.依据是否扩增获得预期的DNA片段或典型扩增曲线,判断试样中是否含有相应的转基因成分.５　试剂和材料除非另有说明,仅使用分析纯试剂和重蒸馏水.５􀆰１　琼脂糖.５􀆰２　１０g/L溴化乙锭(EB)溶液:称取１􀆰０g溴化乙锭,溶解于１００mL水中,避光保存.警告———溴化乙锭有致癌作用,配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废弃物.注:根据需要可选择其他效果相当的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂.５􀆰３　１０mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液:在１６０mL水中加入８０􀆰０g氢氧化钠,溶解后,冷却至室温,再加水定容到２００mL.５􀆰４　５００mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTAＧNa２)溶液(pH８􀆰０):称取１８􀆰６g乙二胺四乙酸二钠,加入７０mL水中,缓慢滴加氢氧化钠溶液(见５􀆰３)直至EDTAＧNa２完全溶解,用氢氧化钠溶液(见５􀆰３)调pH至８􀆰０,加水定容至１００mL.在１０３􀆰４kPa(１２１℃)条件下灭菌２０min.５􀆰５　１mol/L三羟甲基氨基甲烷Ｇ盐酸(TrisＧHCl)溶液(pH８􀆰０):称取１２１􀆰１g三羟甲基氨基甲烷溶解于８００mL水中,用盐酸调pH至８􀆰０,加水定容至１０００mL.在１０３􀆰４kPa(１２１℃)条件下灭菌２０min.５􀆰６　TE缓冲液(pH８􀆰０):分别量取１０mL三羟甲基氨基甲烷Ｇ盐酸溶液(见５􀆰５)和２mL乙二胺四乙酸二钠溶液(见５􀆰４),加水定容至１０００mL.在１０３􀆰４kPa(１２１℃)条件下灭菌２０min.５􀆰７　５０×TAE缓冲液:称取２４２􀆰２g三羟甲基氨基甲烷(Tris),先用５００mL水加热搅拌溶解后,加入１００mL乙二胺四乙酸二钠溶液(见５􀆰４),用冰乙酸调pH至８􀆰０,然后加水定容到１０００mL.使用时用水稀释成１×TAE.５􀆰８　加样缓冲液:称取２５０􀆰０mg溴酚蓝,加入１０mL水,在室温下溶解１２h;称取２５０􀆰０mg二甲基苯腈蓝,加１０mL水溶解;称取５０􀆰０g蔗糖,加３０mL水溶解.混合以上３种溶液,加水定容至１００mL,在４℃下保存.５􀆰９　DNA分子量标准:可以清楚区分１００bp~１０００bp的DNA片段.５􀆰１０　dNTPs混合溶液:将浓度为１０mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP４种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合.５􀆰１１　TaqDNA聚合酶、PCR扩增缓冲液及２５mmol/L氯化镁(MgCl２)溶液.５􀆰１２　普通PCR方法引物检测参数的普通PCR方法引物序列及目的片段大小见表１.表１　普通PCR方法引物组合信息表检测参数引物引物序列(５′~３′)目的片段大小,bpCruAcruAＧFGGCCAGGGTTTCCGTGATcruAＧRCTGGTGGCTGGCTAAATCGA１５０CaMV３５S启动子PCaMV３５SＧFGCTCCTACAAATGCCATCATTGCPCaMV３５SＧRGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC１９５FMV３５S启动子PFMV３５SＧFAAGACATCCACCGAAGACTTAPFMV３５SＧRAGGACAGCTCTTTTCCACGTT２１０NOS终止子TNOSＧFGAATCCTGTTGCCGGTCTTGTNOSＧRTTATCCTAGTTTGCGCGCTA１８０２农业农村部公告第６２８号—１０—２０２２表１(续)检测参数引物引物序列(５′~３′)目的片段大小,bpmCP４Ｇepsps基因mCP４ＧepspsＧFGACTTGCGTGTTCGTTCTTCmCP４ＧepspsＧRAACACCGTTGAGCTTGAGAC２０４bar基因barＧFACAAGCACGGTCAACTTCCbarＧRACTCGGCCGTCCAGTCGTA１７５pat基因patＧFCCGGAGAGGAGACCAGTTGAGATpatＧRTTCCAGGGCCCAGCGTAAG２２７５􀆰１３　实时荧光PCR方法引物和探针检测参数的实时荧光PCR方法引物/探针序列及目的片段大小见表２.探针５′端标记荧光报告基团(如FAM、HEX等),３′端标记对应的淬灭基团(如TAMRA、BHQ１等).表２　实时荧光PCR方法引物和探针组合信息表检测参数引物/探针引物序列(５′~３′)目的片段大小,bpCruA基因cruAＧqFGGCCAGGGTTTCCGTGATcruAＧqRCCGTCGTTGTAGAACCATTGGcruAＧqPAGTCCTTATGTGCTCCACTTTCTGGTGCA１０１CaMV３５S启动子PCaMV３５SＧqFCGACAGTGGTCCCAAAGAPCaMV３５SＧqRAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCPCaMV３５SＧqPTGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC７４FMV３５S启动子PFMV３５SＧqFAAGACATCCACCGAAGACTTAPFMV３５SＧqRAGGACAGCTCTTTTCCACGTTPFMV３５SＧqPTGGTCCCCACAAGCCAGCTGCTCGA２１０NOS终止子TNOSＧqFATCGTTCAAACATTTGGCATNOSＧqRATTGCGGGACTCTAATCATATNOSＧqPCATCGCAAGACCGGCAACAGG１６５mCP４Ｇepsps基因mCP４ＧepspsＧqFGTACCTATGGCTTCCGCTCAAGmCP４ＧepspsＧqRAGTCATGATTGGCTCGATAACAGTmCP４ＧepspsＧqPAGTCCGCTGTTCTGCTTGCTGGTCTCA９３bar基因barＧqFACAAGCACGGTCAACTTCCbarＧqRACTCGGCCGTCCAGTCGTAbarＧqPCCGAGCCGCAGGAACCGCAGGAG１７５pat基因patＧqFGTCGACATGTCTCCGGAGAGpatＧqRGCAACCAACCAAGGGTATCpatＧqPTGGCCGCGGTTTGTGATATCGTTAA１９１５􀆰１４　引物/探针溶液:用TE缓冲液(见５􀆰６)或水分别将上述引物或探针稀释到１０μmol/L.５􀆰１５　石蜡油.５􀆰１６　DNA提取试剂盒.５􀆰１７　定性PCR试剂盒.５􀆰１８　PCR产物回收试剂盒.５􀆰１９　实时荧光PCR试剂盒.６　主要仪器和设备６􀆰１　分析天平:感量０􀆰１g和０􀆰１mg.６􀆰２　PCR扩增仪:升降温速度＞１􀆰５℃/s,孔间温度差异＜１􀆰０℃.６􀆰３　实时荧光PCR仪.６􀆰４　电泳槽、电泳仪等电泳装置.３农业农村部公告第６２８号—１０—２０２２６􀆰５　凝胶成像系统或照相系统.７　操作步骤７􀆰１　抽样按NY/T６７２和农业部２０３１号公告—１９—２０１３的规定执行.７􀆰２　试样制备按NY/T６７２和农业部２０３１号公告—１９—２０１３的规定执行.７􀆰３　试样预处理按农业部１４８５号公告—４—２０１０的规定执行.７􀆰４　DNA模板制备按农业部１４８５号公告—４—２０１０的规定执行.７􀆰５　PCR扩增７􀆰５􀆰１　普通PCR方法７􀆰５􀆰１􀆰１　试样PCR扩增７􀆰５􀆰１􀆰１􀆰１　每个试样PCR扩增设置３个平行.７􀆰５􀆰１􀆰１􀆰２　按表３依次加入反应试剂,混匀,分装到PCR管中,再加２５μL石蜡油(有热盖功能的PCR仪可不加).也可采用经验证的、效果相当的定性PCR试剂盒配制反应体系.表３　普通PCR扩增体系试剂终浓度体积ddH２O—１０×PCR缓冲液１×２􀆰５μL２５mmol/L氯化镁溶液１􀆰５mmol/L１􀆰５μLdNTPs混合溶液(各２􀆰５mmol/L)０􀆰２mmol/L２􀆰０μL１０μmol/L上游引物０􀆰４μmol/L１􀆰０μL１０μmol/L下游引物０􀆰４μmol/L１􀆰０μLTaqDNA聚合酶０􀆰０２５U/μL—２５mg/L