TCVMA 13-2018 H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法

ICS11.220B41团体标准T/CVMA13—2018H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法Duplexreal-timeRT-PCRassayfordetectionofavianinfluenzaA(H7N9)virus2018-10-24发布2018-10-24实施中国兽医协会发布中国兽医协会CVMAT/CVMA13—2018I前言本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心本标准主要起草人：刘玉良、王传彬、宋晓晖、吴佳俊、杨林、孙明、陈西钊、乔明明、蒋菲、顾小雪、刘洋、张硕、韩焘、赵柏林。中国兽医协会CVMAT/CVMA13—20181H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测试剂、仪器设备、实验操作步骤。本标准适用于禽组织、分泌物、排泄物和培养物中H7N9亚型禽流感病毒检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3试剂3.1RNA提取试剂RNA提取试剂详见附录A.1～A.4，或选取商品化的病毒RNA提取试剂盒。3.25×RT-PCR缓冲液Trisbase15.14gKCl13.98gMgCl2.6H2O1.53gDTT3.86g加无核酸酶灭菌蒸馏水至400mL，调pH值至8.3（室温下），定容至500mL。过滤（0.22μm）除菌后置于2℃～8℃保存备用。3.3.10×PCR缓冲液的配制Trisbase6.06gKCl18.64gTritonX-1005.00mL加无核酸酶灭菌蒸馏水至400mL，用HCl调pH值至9.0（室温下），定容至500mL。高压灭菌冷却后置于2℃～8℃保存备用。3.3引物和探针中国兽医协会CVMAT/CVMA13—20182表1所用引物和探针3.4其他试剂TaqDNA聚合酶（5U/µL）、AMV反转录酶（10U/µL）、RNA酶抑制剂（40U/µL）、无水乙醇、无核酸酶灭菌蒸馏水、生理盐水。4仪器设备分析天平、高速离心机、荧光PCR仪、组织研磨仪、-20℃冰箱、可调移液器。5操作步骤5.1样品采集样品采集按照NY/T541进行。对于病死禽，取脑、肺、气管、喉头等组织；对于活禽，用棉拭子轻轻分别采集同一只禽的咽喉分泌物和少量泄殖腔粪便，放在含有保护液（50%甘油生理盐水）的同一离心管中，加盖，编号。5.2样品处理5.2.1组织样品每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，剪碎后取适量于研磨器中研磨，加入1.0mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至灭菌离心管中，10,000×g离心2min，取上清液100µL于1.5mL灭菌离心管中。5.2.2分泌物和排泄物样品名称序列（5＇-3＇）目的基因HA-7-FTGGTTTAGCTTCGGGGCRTCATHAHA-7-RACAAATAGTGCACYGCATGTTTCCHA-7-PFAM-CCATTGYAATGGGYCT-MGBNA-9-FACACTCAAACGGAACAATACACGNANA-9-RGACCACCCAATGCATTCCACNA-9-PHEX-AAGCTGGCCACTATC-MGB注1：将表中引物和探针均用无核酸酶灭菌蒸馏水稀释至10pmol/µL后使用。注2：引物序列中，R代表A或G碱基；Y代表C或T碱基中国兽医协会CVMAT/CVMA13—20183将咽喉/泄殖腔棉拭子在振荡器上充分混合，捻动、挤压干后弃去拭子。10,000×g离心5min，吸取上清100µL于1.5mL灭菌离心管中。5.2.3培养物样品将培养物10,000×g离心5min，取上清100µL于1.5mL灭菌离心管中。5.3病毒RNA的提取5.3.1若选用附录A中所列试剂提取病毒RNA，则参照以下步骤进行操作：a)取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600µL，充分颠倒混匀，室温静置3min～5min；b)将液体吸入吸附柱中，10,000×g离心30s；c)弃去收集管中液体，加入600µL洗涤液，10,000×g离心30s；d)重复上述步骤c）进行洗涤；e)弃去收集管中液体，10,000×g离心2min，以除去残留的洗涤液；f)将吸附柱移入新的1.5mL无菌离心管中，向柱中央加入洗脱液50µL，室温静置1min，10,000×g离心30s，离心管中液体为模板RNA。5.3.2若使用病毒RNA试剂盒提取病毒RNA，则按试剂盒说明书进行操作。5.4双重实时荧光RT-PCR扩增按照表2配制双重实时荧光RT-PCR扩增反应体系。表2双重实时荧光RT-PCR扩增反应体系项目试剂体积HA引物和探针HA-7-F0.80µLHA-7-R0.80µLHA-7-P0.80µLNA引物和探针NA-7-F0.80µLNA-7-R0.80µLNA-7-P0.80µLPCR反应溶液无核酸酶灭菌蒸馏水3.60µL5×RT-PCR缓冲液4.00µL10×PCR缓冲液2.00µLAMV反转录酶0.25µLRNA酶抑制剂0.15µLTaqDNA聚合酶0.20µLRNA模板5.00µL总体积20.0µL注：如仅需扩增HA或NA基因，则选择表中扩增该基因的相应引物和探针以及PCR反应溶液配制反应体系，同时增加无菌核酸酶灭菌蒸馏水至6.00µL。中国兽医协会CVMAT/CVMA13—20184将表2中试剂加到荧光RT-PCR反应管后，充分混匀，做好标记。扩增HA基因的荧光报告基团为FAM，扩增NA的为HEX（如果仪器未经HEX校正过，可用VIC代替），淬灭基团为BHQ或MGB。在荧光PCR仪上按表3所示程序进行扩增反应。表3荧光RT-PCR扩增程序5.5荧光RT-PCR反应对照吸取含灭活的H7N9亚型禽流感病毒的鸡胚尿囊液100µL至1.5mL灭菌离心管中，作为阳性对照；吸取SPF鸡胚尿囊液100µL至1.5mL灭菌离心管中，作为阴性对照。各对照RT-PCR扩增体系中，除模板外，其余组分和RT-PCR扩增程序与5.4相同。5.6结果分析5.6.1实验成立条件阳性对照Ct值≤30并出现典型的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无典型的扩增曲线，实验结果成立，实例可参考附录B.1。5.6.2阈值设定阈值线设定于刚刚超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。5.6.3结果判定若被检样品FAM荧光信号Ct值≤30并出现典型的扩增曲线，则判为H7阳性，实例可参考附录B.2；若被检样品HEX荧光信号Ct值≤30并出现典型的扩增曲线，则判为N9阳性，实例可参考附录B.3；若被检样品30＜Ct＜35并出现典型的扩增曲线，需重新取样提取RNA，扩增后进行结果判定，如仍是可疑，可判定为阳性；被检样品Ct值≥35时，超过本方法检测灵敏度范围，判定为阴性；对于某些未呈现S型曲线，但本底较高的样品，判为阴性。步骤温度持续时间循环数142℃30min1294℃3min1394℃15s40453℃10s560℃30s注：在每个循环第二步（60℃）延伸时收集荧光信号。中国兽医协会CVMAT/CVMA13—20185附录A(规范性附录)试剂的配制A.1保护液（50%生理盐水）将生理盐水缓慢倒入盛有甘油的容器中，按1:1体积比充分混合。A.2裂解液异硫氰酸胍236.4g氯化钠23.2g0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（EDTA）（pH=8.0）40mL灭菌双蒸水加至2000mLEDTA（0.5mol/L,pH=8.0）溶液配制EDTA18.61g灭菌双蒸水80mL氢氧化钠调pH至8.0（室温下）灭菌双蒸水加至100mLA.3洗涤液磷酸氢二钠143.2g磷酸二氢钾62.4g氯化钠18g灭菌双蒸水加至2000mL再加入6000mL无水乙醇，充分混匀。A.4洗脱液磷酸氢二钠143.2g磷酸二氢钾62.4g灭菌双蒸水加至2000mL中国兽医协会CVMAT/CVMA13—20186附录B（资料性附录）荧光RT-PCR扩增实例参照B.1H7N9荧光RT-PCR扩增阳性B.2H7(HA)荧光RT-PCR扩增阳性B.3N9(NA)荧光RT-PCR扩增阳性H7阴性对照N9阴性对照H7N9阴性对照中国兽医协会CVMAT/CVMA13—20187中国兽医协会CVMA