BJS 201707 植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定

—1——附件植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定BJS2017071范围本方法规定了食品核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分鉴定的实时荧光PCR方法。本方法适用于核桃露（乳）、杏仁露、果仁露等复合植物蛋白饮料中标识含有核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的检测及鉴定。2原理提取试样中基因组DNA，以DNA为模板，利用物种特异性引物及探针进行实时荧光PCR扩增检测，同时设置阳性、阴性及空白对照。根据扩增的Ct值，判定试样中是否含有该源性成分。3试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。3.1核桃源性成分Jugr2基因检测用引物对序列为：核桃5’端引物:5’-CGCGCAGAGAAAGCAGAG-3’核桃3’端引物:5’-GACTCATGTCTCGACCTAATGCT-3’核桃探针：5’-FAM-TTGTGCCTCTGTTGCTCCTCTTCCC-TAMRA-3’3.2花生源性成分Arab2基因检测用引物（对）序列为：花生5’端引物:5’-GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG-3’花生3’端引物:5’-CGCTGTGGTGCCCTAAGG-3’花生探针：5’-FAM-AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG-Eclipse-3’3.3杏仁源性成分Prudul基因检测用引物（对）序列为：杏仁5’端引物:5’-TTTGGTTGAAGGAGATGCTC-3’杏仁3’端引物:5’-TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG-3’杏仁探针：5’-FAM-TCCATCAGCAGATGCCACCAAC-Eclipse-3’3.4芝麻源性成分2SalbumimmRNA基因检测用引物（对）序列为：芝麻5’端引物:5’-CCAGAGGGCTAGGGACCTTC-3’—2——芝麻3’端引物:5’-CTCGGAATTGGCATTGCTG-3’芝麻探针：5’-FAM-TCGCAGGTGCAACATGCGACC-TAMRA-3’3.5榛子源性成分oleosin基因检测用引物（对）序列为：榛子5’端引物:5’-CCCCGCTGTTTGTGATAT-3’榛子3’端引物:5’-ATGATAATAAGCGATACTGTGAT-3’榛子探针：5’-FAM-TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT-Eclipse-3’3.6大豆源性成分Lectin基因检测用引物（对）序列为：大豆5’端引物:5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’大豆3’端引物:5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’大豆探针：5’-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-TAMRA-3’3.7真核生物18SrRNA内参照检测用引物（对）序列为：内参照5’端引物:5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’内参照3’端引物:5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’内参照探针：5’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-TAMRA-3’3.8CTAB缓冲液：55mmol/LCTAB，1400mmol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris，用10%盐酸调节pH至8.0，121℃高压灭菌20min,备用。3.9蛋白酶K：20mg/mL。3.10苯酚：氯仿：异戊醇（体积比：25:24:1）。3.11异丙醇。3.1270%乙醇。3.13TaqDNA聚合酶。3.14dNTP混合液。3.15TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）：10mmol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。3.1610×PCR缓冲液：200mmol/LKCl，15mmol/LMgCl2，200mmol/LTris-HCl（pH8.8）。4仪器和设备4.1组织研磨器。4.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。4.3恒温水浴锅。4.4离心机：离心力12,000g。4.5微量移液器（0.5μL~10μL，10μL~100μL，10μL~200μL，100μL~1000μL）。4.6实时荧光PCR仪。4.7涡旋振荡器。—3——4.8天平：感量0.01g。5分析步骤5.1试样总DNA的提取固体样品：将样品粉碎后称取0.3~0.6g，按下列方法提取DNA。也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA。液体样品：取1mL样品于Eppordorf管中，加入1倍体积的异丙醇，混合均匀，室温下沉淀5min，室温下以12,500rpm离心5min，弃去上清液。重复此操作一次。所得的沉淀用于提取DNA。可按下列方法提取DNA，也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA。（1）将处理后的样品加入2mL离心管中，加入600μLCTAB缓冲液和40μL蛋白酶K溶液，振荡混匀，65℃孵育1h（过夜孵育更好）,期间每隔10min振荡混匀；（2）加入500μL的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），振荡抽提10min，室温下以12,500rpm离心10min；（3）小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，振荡均匀，12,500rpm离心10min；（4）弃去上清液，用65℃预热的TE缓冲液溶解DNA；（5）小心吸取上清，加入200μL氯仿：异戊醇（24:1），振荡抽提，室温下以12500rpm离心15min；（6）小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，振荡均匀，12,500rpm离心10min；（7）弃去上清液，沉淀用70%乙醇洗涤，离心1min，晾干，溶于50μLTE缓冲液中。5.2DNA浓度和纯度的测定取1μLDNA溶液，使用核酸蛋白分析仪检测其浓度及质量，OD260/280值应在1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增。5.3实时荧光PCR扩增反应体系总体积为25μL，其中10×PCR缓冲液5μL，正反向引物（10μmol/L）各1μL，探针（10μmol/L）1μL，dNTPs（10μmol/L）2μL，TaqDNA聚合酶（2.5U）0.2μL，DNA模板（10-100ng/μL）2μL，用灭菌去离子水补足至总体积25μL。真核生物内参照的反应体系同上，仅替换相应的引物和探针。也可使用相应的商品化扩增试剂盒。反应参数：50℃2min；95℃15min；95℃15s，60℃1min，40个循环。5.4实验对照检验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以相应植物源物种提取的DNA为阳性对照，以已知不含该植物源的物种DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照。样品、内参照和对照设置两个平行的反应体系。—4——6结果判断与表述6.1质量控制以下条件有一条不满足时，结果视为无效：(a)空白对照：无FAM荧光信号检出；(b)阴性对照：无FAM荧光信号检出；(c)阳性对照：有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct值≤35.0；(d)内参对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0。6.2结果判定(a)如Ct值≤35.0，则判定为被检样品阳性；(b)如Ct值≥40.0，则判定为被检样品阴性；(c)如35.0＜Ct值＜40.0，则重复试验一次。如再次扩增后Ct值仍为35.0＜Ct值＜40.0，则判定被检样品可疑。6.3结果表述结果为阳性者，结合产品标识，表述为“检出XX源性成分”。结果为阴性者，结合产品标识，表述为“未检出XX源性成分”。结果为可疑者，结合产品标识，表述为“XX源性成分可疑”。7防污染措施检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T27403中的规定执行。本方法负责起草单位：河北省食品检验研究院。验证单位：中国食品药品检验研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、湖北省食品质量安全监督检验研究院、武汉食品化妆品检验所、河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国肉类食品综合研究中心。主要起草人：周巍、王爽、章晶晶、崔生辉、李永波、孙勇。