农业农村部公告第327号 羟氯扎胺每日允许摄入量和最高残留限量标准(试行)及残留检测方法标准(试行)

附件6羟氯扎胺每日允许摄入量和最高残留限量标准（试行）及残留检测方法标准（试行）羟氯扎胺每日允许摄入量和最高残留限量标准（试行）申报单位参照欧盟有关标准制定了羟氯扎胺的每日允许摄入量（ADI）和羟氯扎胺在牛奶及牛组织中的最高残留限量（MRLs），如下表：活性成分残留标志物动物品种靶组织MRLs羟氯扎胺ADI：0～30μg/kgb.w./d羟氯扎胺牛牛奶10μg•kg-1肌肉20μg•kg-1肾脏100μg•kg-1肝脏500μg•kg-1脂肪20μg•kg-1羟氯扎胺残留检测方法标准（试行）牛可食性组织及牛奶中羟氯扎胺残留量检测液相色谱-串联质谱法（试行）1范围本标准规定了牛可食性组织及牛奶中羟氯扎胺残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于牛肌肉、肝脏、肾脏、脂肪组织以及牛奶中羟氯扎胺残留量的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T1.1-2000标准化工作导则第1部分标准的结构和编写规则（ISO/IECDirectives,Part3,1997,RulesforthestructureanddraftingofInternationalStandards,NEQ）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试料中残留的羟氯扎胺，用乙腈-丙酮（60∶40，V/V）溶液（肌肉、肝脏和肾脏组织）或1%三乙胺乙腈溶液（脂肪组织和牛奶）超声提取，阴离子固相萃取柱净化，乙腈饱和的正己烷除脂后，经高效液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。4试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1羟氯扎胺对照品：含量99.0%4.2乙腈：色谱纯。4.3甲酸：色谱纯。4.4甲醇：色谱纯。4.5丙酮：分析纯。4.6三乙胺。4.7正己烷。4.8氨水。4.9无水硫酸钠。4.10乙腈-丙酮混合液：取600份的乙腈与400份的丙酮混匀。4.111%三乙胺乙腈溶液：取1.0mL三乙胺，用乙腈稀释并定容至100mL，混匀。4.120.3%甲酸乙腈溶液：取3.0mL甲酸，用乙腈稀释至1000mL，混匀。4.1325%氨化乙腈溶液：取25mL氨水，用乙腈稀释至100mL，混匀。4.145%甲酸乙腈溶液：取5.0mL甲酸，用乙腈稀释至100mL，混匀。4.155%氨水溶液：取5.0mL氨水，用水稀释至100mL，混匀。4.160.1%甲酸溶液：取1.0mL甲酸，用超纯水定容至1000mL，混匀。4.17乙腈饱和的正己烷：取1份乙腈和2份的正己烷，混匀，静置分层，取正己烷层。4.18羟氯扎胺标准储备液（1000μg/mL）：准确称取10.15mg羟氯扎胺对照品，置于10mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，即成1000μg/mL的羟氯扎胺标准储备溶液，-20℃冰箱中保存。有效期6个月。5仪器和设备5.1高效液相色谱－串联质谱仪：配电喷雾电离源。5.2分析天平：感量0.00001g。5.3天平：感量0.01g。5.4组织匀浆机。5.5离心机：转速大于8000r/min以上。5.6轨道式摇床。5.7涡旋振荡器。5.8移液器：量程为10～100μL、20～200μL、100～1000μL、1000～5000μL。5.9氮气浓缩仪。5.10固相萃取小柱：Poly-SeryMAX混合型阴离子交换SPE小柱，规格：60mg，3mL。5.11离心管：50mL、10mL。5.12微孔滤膜：0.22μm，有机系。6试样的制备与保存6.1试料的制备取适量新鲜或解冻的空白或供试牛肌肉、脂肪、肾脏，除去组织上多余的其他组织和筋腱，切碎后经高速组织均质机捣碎。——取均质的供试样品，作为供试试料。——取均质的空白样品，作为空白试料。——取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。6.2试料的保存-20℃以下保存。7测定步骤7.1提取7.1.1肌肉、肝脏、肾脏组织样品准确称取组织样品（2.00±0.02）g，置于50mL离心管中，加入乙腈-丙酮混合液15mL，漩涡混悬15s，超声提取10min，300r/min振荡10min，4℃下8000r/min离心10min后收集上清液；上清液中加入1mL5%氨水待净化。7.1.2脂肪组织样品准确称取组织样品（2.00±0.02）g，置于50mL离心管中，加入1%三乙胺-乙腈溶液15mL，漩涡混悬15s，超声提取10min，300r/min振荡10min，8000r/min离心10min后收集上清液；上清液中加入2mL5%氨水后置于-20℃冷藏1h，取出后在4℃下8000r/min离心10min。上清液转移至另一50mL离心管中待净化。7.1.3奶样品准确称取牛奶样品（5.00±0.05）g，置于50mL离心管中，加入无水硫酸钠1g，再加入1%三乙胺乙腈溶液10mL，漩涡混悬1min，300r/min振荡10min，4℃下8000r/min离心10min后收集上清液；上清液中加入2mL5%氨水待净化。7.2净化MAX固相萃取柱预先用25%氨化乙腈溶液3mL活化，再将前述上清液装载入柱，以1mL/min流速过柱。待上清液流出后，依次用水3mL和甲醇3mL分别淋洗，负压抽干后用3mL5%甲酸-乙腈溶液洗脱，收集洗脱液，在40℃下氮气吹干，残渣用1mL0.3%甲酸乙腈溶液溶解，转移至2mL离心管，加入乙腈饱和的正己烷0.5mL，涡旋，于4℃下15000r/min离心10min，上清液过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。7.3基质匹配标准曲线的制备肌肉、脂肪准确称取2.00g±0.02g空白匀浆组织于5mL离心管中，按“7.1”与“7.2”方法处理，洗脱吹干。取0.3%甲酸-乙腈配制的2.5、5、10、20、40、80、100μg/L标准工作液1mL溶解残渣，制备出浓度为1.25、2.5、5、10、20、40、50μg/kg基质匹配标准工作液，涡旋混匀，加入乙腈饱和的正己烷0.5mL，涡旋混匀，于4℃下15000r/min离心10min，取下层液过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。肝脏准确称取2.00g±0.02g空白匀浆组织于5mL离心管中，按“7.1”与“7.2”方法处理，洗脱吹干。取0.3%甲酸-乙腈配制的2.5、5、100、250、500、1000、2000μg/L标准工作液1mL溶解残渣，制备出浓度为1.25、2.5、50、125、250、500、1000μg/kg基质匹配标准工作液，涡旋混匀，加入乙腈饱和的正己烷0.5mL，涡旋混匀，于4℃下15000r/min离心10min，取下层液过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。肾脏准确称取2.00g±0.02g空白匀浆组织于5mL离心管中，按“7.1”与“7.2”方法处理，洗脱吹干。取0.3%甲酸-乙腈配制的2.5、5、25、50、100、200、400μg/L标准工作液1mL溶解残渣，制备出浓度为1.25、2.5、12.5、25、50、100、200μg/kg基质匹配标准工作液，涡旋混匀，加入乙腈饱和的正己烷0.5mL，涡旋混匀，于4℃下15000r/min离心10min，取下层液过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。牛奶准确称取5.00g±0.05g空白牛奶于5mL离心管中，按“7.1”与“7.2”方法处理，洗脱吹干。取0.3%甲酸-乙腈配制的5、10、25、50、100、250、500、100μg/L标准工作液1mL溶解残渣，制备出浓度为1、2、5、10、20、50、100、200μg/kg基质匹配标准工作液，涡旋混匀，加入乙腈饱和的正己烷0.5mL，涡旋混匀，于4℃下15000r/min离心10min，取下层液过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，对应的基质匹配标准溶液浓度为横坐标，绘制基质匹配标准曲线。将测得的药物色谱峰面积（Y）与所对应的药物浓度（X）做线性回归，求得标准曲线回归方程和相关系数（R2）。每一浓度平行测6次。超过标准上限的供试样品，用空白基质稀释至标曲范围之内，进行LC-MS/MS测定。7.4测定7.4.1色谱条件色谱柱：C18（150mm×2.1mm，粒径3.5µm），或相当者；柱温：35℃；进样量：5L；流速：0.25mL/min；流动相：乙腈+0.1%甲酸-水；梯度洗脱程序见表1。表1液相色谱梯度洗脱条件时间（min）0.1%甲酸-水（%）乙腈（%）09550.29550.55953.05953.19556.09557.4.2质谱条件离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测；离子源温度：650℃；喷雾电压（ionsprayvoltage,IS）：-3500V；雾化气电压（nebulizergas,GS1）：60psi辅助气流速（ionsourcegas2,GS2）：60L/min气帘气压力（curtaingas,CUR）：15psi碰撞室压力（CAD）：8psi；定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量见表2。表2羟氯扎胺定性离子对、定量离子对及锥孔电压、碰撞电压的参考值化合物定性离子对(m/z)定量离子对(m/z)CE(eV)DP(V)CXP(V)羟氯扎胺398＞175.9398＞175.9-36-68-10398＞201.6-30-58-17注：其中带*的离子对是用来进行分析的离子对；CE：碰撞能量（CollisionEnergy）；DP：去簇电压（DeclusteringPotential）；CXP：碰撞室射出电压（CollisionCellExitPotertial）。7.5测定法7.5.1定性测定通过样品色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。试样与标准品保留时间的相对偏差不大于2.5％；样品特征离子相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断试样中存在相应的被测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许误差相对离子丰度＞50%＞20%至50%＞10%至20%≤10%允许的最大偏差±20%±25%±30%±50%7.5.2定量测定取试样溶液和基质匹配标准溶液，按外标法，以峰面积定量。基质匹配标准溶液及试样溶液中的羟氯扎胺的峰面积应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱-质谱条件下，空白添加试样溶液中特征离子质量色谱图见附录A。7.6空白试验除不加试料外，采用完全相同的步骤进行平行操作。8结果计算和表述将标准曲线的浓度和对应峰面积进行回归分析，然后按下式计算。式中：X——供试试料中相应的羟氯扎胺残留量，g/kg；A——试样溶液中相应的羟氯扎胺峰面积；b——标准曲线回归方程中截距；a——标准曲线回归方程中斜率。V——溶解残余物所用溶液体积，mL；m——供试试料质量，g。8.2单点校准式中：——试样中羟氯扎胺残留量，μg/kg；——羟氯扎胺标准工作溶液的浓度，μg/L；——试样溶液中羟氯扎胺峰面积；——对照溶液中羟氯扎胺峰面积；——试样溶液定容体积，mL；——试样溶液所代表试样的量，g。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留至小数点后2位。9检测方法灵敏度、准确度和精密度9.1灵敏度本方法中羟氯扎胺在牛组织中的检测限均为1μg/kg，定量限均为2.5μg/kg；在牛奶中的检测限为1μg/kg，定量限为2μg/kg。9.2准确度本方法在牛可食性组织中添加LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL四个浓度水平上的回收率为80%～115%。牛奶中添加LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL四个浓度水平上的回收率为70%～120%。9.3精密度本方法批内相对标准偏差≤10%，批间相对标准偏差不大于20%。附录A(资料性附录)XICof-MRM(2pairs):398.000/175.900DafromSample2(bovineliver-bl