地震后危重多发伤伴混合感染病例分析

题名页地震后危重多发伤伴混合感染病例分析张山，李思，王文武微生物与感染编辑部，上海200032基金项目：国家高新技术研究发展计划（863）（2009ZZ06…）第一作者：张山，详细联系方式（电话、E-mail）通信作者：王文武，详细联系方式（电话、E-mail）地震后危重多发伤伴混合感染病例分析张山，李思，王文武微生物与感染编辑部,上海200032摘要：为证实乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）3022nt-1787nt缺失突变体编码蛋白TS'X'（源于DNA聚合酶读码框架，T代表TP区，S'为部分缺失的spacer区，X'为截短的X蛋白）具有抗干扰素（IFN-）作用并确定其功能区域，首先以聚合酶链反应（PCR）扩增获得TS'X'全长及片段TS'（含TP区及部分缺失的spacer区），并克隆于pcDNA3.1/HisC载体。重组载体以FuGENE6转染Huh7肝细胞，48h后裂解细胞，通过融合表达的多肽表位抗体，以蛋白质印迹法（Westernblot）证实目的蛋白可在Huh7肝细胞中表达。重组载体及空载体pcDNA3.1/HisC分别与IFN-反应报告载体p6-16CAT按分子数5:1、10:1、15:1、30:1共转染Huh7肝细胞，转染后48h给予终浓度为100IU/ml的IFN-2a刺激，作用24h后裂解细胞，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测胞内氯霉素乙酰基转移酶（CAT）含量。结果显示，与空白载体相比，随着TS'X'及TS'重组表达载体转染量的递增，Huh7胞内CAT值逐渐降低（n＝6，P0.05），但TS'X'与TS'之间无显著差异(n＝6，P0.05)。本研究证实HBV3022nt-1787nt缺失突变体编码的TS'X'蛋白可抑制Huh7细胞对IFN-的反应性，其活性与其N端TP及部分缺失的Spacer区有关。关键词：海分枝杆菌；转座子突变；斑马鱼；肉芽肿───────────────基金项目：国家高新技术研究发展计划（863）（2009ZZ06…）通信作者：王文武Correspondingautor.WANGWen-Wu,E-mail:[e-mail]ultipletraumawithmixedinfectionsamongearthquakevictimsZHANGShan,LISi,WANGWen-WuJournalofMicrobesandInfection,Shanghai200032,ChinaAbstract：Thepurposeofthecurrentstudyistoinvestigatetheanti-IFN-effectsandtodeterminethefunctionalregionofthenovelproteinTS'X'encodedbythe3022nt-1787ntdeletionmutantofhepatitisBvirus(HBV).RegionscodingforTS'X'(inframewiththeopeningreadingframeofDNApolymerase,inwhichTstandsforterminalprotein,S'forpartiallydeletedspacerregion,andX'fortruncatedXprotein)andTS'(N-terminalofTS'X'containingterminalproteinandpartiallydeletedspacerregion)wereamplifiedbymeansofPCRandclonedintothepcDNA3.1/HisCvectorseparately.TherecombinantvectorwastransfectedintoHuh7hepatocytesindividuallybyFuGENE6transfectionreagent,andtheexpressionofthefusionproteinwasverifiedbyWesternblotanalysis.Therecombinantoremptyvectorwasco-transfectedtoHuh7hepatocyteswithIFN-responsereporterplasmidp6-16CATatthemolarratioof5:1,10:1,15:1and30:1,cellsweretreatedwithIFN-2a48hourspost-transfection.After24hoursofstimulation,thecellswerelysedandtheintracellularCATvaluewascalculatedbyELISAassay.Theresultsdemonstratedthat,ascomparedtotheemptyvector,theintracellularCATvaluesweregraduallyreducedasparalleledwithanincreasingamountofTS'X'orTS'recombinant(n＝6，p0.05),whilenosignificantdifferenceswereobservedbetweenthem(n＝6，p0.05).ItwasconcludedthatthenovelproteinTS'X'encodedbythe3022nt-1787ntdeletionmutantofHBVsuppressedtheresponseofHuh7hepatocytestoIFN-，andtheN-terminalregionwasafunctionaldomainforitsanti-IFN-effects.Keywords：Mycobacteriummarinum;Transposon;Zebrafish;Granuloma长久以来，分枝杆菌的细胞壁被认为是其致病性中的重要部分，他不仅可以帮助结核菌抵抗多种恶劣的理化及宿主体内环境，有利于结核菌抵抗大多数常用的抗生素，而且已证实多种细胞壁成分与其毒力密切相关[1,2]。此外，多种的抗结核药物，如异烟肼和乙胺丁醇，作用的靶位点位于细胞壁的代谢通路[3]。因此研究分枝杆菌细胞壁中与毒力相关的成分有可能为开发新的抗结核药提供新靶点，为发展新的预防结核病的疫苗提供新线索。本研究利用噬菌体MycoMarT7转座子系统建立了海分枝杆菌的随机突变库，以菌落形态及索状结构的改变为筛选标志获得了3个mas同源基因的插入突变株，并探讨了其致病性。流行性乙型脑炎（epidemicencephalitistypeB）是由乙型脑炎病毒引起的以脑实质炎症为主要病变的中枢神经系统急性传染病，又称日本乙型脑炎[1]。临床上多以急性起病、高热、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭、脑膜刺激征为主要表现。为提高临床医师对该疾病的认识，我们对本院2005―2008年收治住院的30例乙型脑炎患者流行病学及临床特征进行回顾性分析。1临床材料1.1病例患者，男性，78岁，农民。间断性咳嗽、咳痰4年，加重1个月，于2008年10月13日入住甘肃省兰州市肺科医院。痰标本编号：866。患者自述4年前开始每遇天气转凉即出现咳嗽，咳白色黏液性痰，并伴气短，多次于外院就诊，诊断为“慢性支气管炎，肺心病”。给予抗炎利痰对症治疗后，症状缓解。否认服用抗结核药。入院前1个月上述症状逐渐加重，对症治疗，疗效欠佳。入院时查体：腋下体温36℃，心率80次/min，血压155/95mmHg。神志清，精神欠佳，体形正常，扶入病房。咽部无充血，扁桃体无肿大，双侧呼吸动度减弱，叩诊过清音，双肺呼吸音粗，肺底可闻及细湿罗音。腹平软，无压痛反跳痛，肝脾不大。血常规检查：白细胞2.9×109/L，淋巴细胞绝对值0.8×109/L，红细胞6.55×1012/L,血红蛋白含量208g/L，平均红细胞血红蛋白含量31.7pg。生化检查：谷丙转氨酶57u/L，谷草转氨酶41u/L，谷草转氨酶/谷丙转氨酶0.7，载脂蛋白A0.94g/L，载脂蛋白B1.18g/L，乳酸脱氢酶260u/L，腺苷脱胺酶31u/L，转铁蛋白6.08g/L，β2-微球蛋白3.3mg/L。胸水生化显示总蛋白52g/L，腺苷脱胺酶64g/L，转铁蛋白1.26g/L。胸水涂片见大量散在的淋巴细胞。胸水中甲胎蛋白0.83ng/ml、癌胚抗原0.58ng/ml、肿瘤相关因子18.78u/ml。入院后常规痰检示痰涂片抗酸杆菌阴性。胸部计算机断层扫描（computedtomography，CT）显示：双肺间质纹理增重，肺内散布片絮状高密度灶，伴双侧胸腔积液，纵隔可见钙化的淋巴结，左心室增大。入院诊断为肺心病。肺部有炎症，给予左氧氟沙星0.4g/d，静脉点滴1周；头孢他啶2g/d，静脉点滴1d；诊断性抗痨治疗（对氨基水杨酸异烟肼片0.3g，每天1次；利福平0.45g，每天1次；乙胺丁醇0.75g，每天1次）和对症支持治疗，15d后症状好转出院。1.2材料和方法1.2.1主要试剂Middlebrook7H9（8X07131）、MiddlebrookMGIT-960液体培养基购于美国BD公司，小牛血清组分v（A8020）和过氧化氢酶（C8070）购于瑞士罗氏制药公司，基因组提取试剂盒（N9021）购于东盛生物有限公司，DNASTAR聚合酶和胶回收试剂盒购于TaKaRa，TaqDNA聚合酶为美国Fermentas公司产品，鸡蛋为正大鲜鸡蛋。1.2.2显微镜镜检取患者晨起漱口后咳出深部的痰做检查。①抗酸染色：将痰涂片，加热固定，碱性石炭酸复红初染，3%盐酸酒精脱色，亚甲基蓝复染，干燥后光学显微镜下镜检[8]。②革兰染色：将痰涂片，自然干燥，结晶紫初染，碘液媒染，95%乙醇脱色，稀释复红复染，干燥后光学显微镜下镜检[8]。1.2.3痰标本的细菌培养取患者晨起漱口后咳出深部的痰做标本，经消化、离心、弃上清液后加入适量磷酸缓冲液（phosphate-bufferedsaline，PBS），重悬、沉淀，取300μl分别接种于MiddlebrookMGIT7H9液体、含蔗糖的7H9（7H9-L）半固体、不含蔗糖的Middlebrook7H9（7H9-B）半固体、含氯化钠的92-3TB（92-3TB-L）液体和不含氯化钠的92-3TB（92-3TB-B）液体培养基[9]及罗氏（Lownstein-Jenson，L-J）培养基中，37℃静置培养。1.2.4细菌回复实验将该菌株培养至呈煎蛋样生长的L型细菌，接种于罗氏培养基或7H9-B半固体培养基，观察细菌生长状况及形态改变。1.2.5扫描电镜观察刮取培养的菌落置于1.5ml的Eppendorf管中，加入3%磷酸戊二醛固定过夜，在兰州大学医学实验中心电镜室处理并扫描电镜观察。2结果痰标本经培养，在92-3TB-L液体培养基出现浑浊，表明有细菌生长。在7H9-L半固体含蔗糖培养基中有油煎蛋样的菌落出现。抗酸染色可见抗酸染色阴性、大小不等、圆形或短杆状的细菌。在罗氏培养基和7H9-B中传代培养2代后，可见有少量细菌回复为抗酸染色弱阳性杆状菌（图1）。革兰染色可见紫红色杆状菌（图2D）。扫描电子显微镜下可见传代培养后菌落呈团块状生长，菌体呈杆状。PCR产物扩增16SrRNADNA的测序结果与支气管戈登菌DSM43247相似性100%（图2），可见从该患者痰液中分离培养出支气管戈登菌的L型细菌。药敏实验显示，该细菌对利福平、利福喷丁、阿莫西林、左氧氟沙星和克拉霉素敏感，对异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、对氨基水杨酸、甲硝唑和呋喃唑酮耐药（图3、表1）。3讨论在结核分枝杆菌中，pps位点（包括fadD26至fadD28的全部基因，见图3）45kb的大片段与PDIM的合成密切相关。3.1流行病学特征目前全世界乙型脑炎每年发病约50000例，其中约1/3死亡，存活者20%～30%有神经