质谱技术简介及在临床生化中的应用-金中淦

质谱技术简介及在临床生化中的应用参考实验室金中淦•质谱的发展•质谱的基本原理•质谱在临床生化的应用主要内容质谱的发展质谱的发展质谱的发展质谱发展史上具有里程碑式的人物7质谱是什么？特殊的天平：称量离子的质量质谱的基本原理质谱的基本原理•质谱技术：测量分子质荷比(m/z)的分析方法•它通过将分子电离后形成带电离子,并按照离子m/z的大小顺序排列形成谱图数据•质谱仪是一类可以将样品分子转化成带电离子并利用适当的电场磁场实现离子m/z分离进而检测每种离子的峰强度进行物质分析的仪器100200300400500600m/z0100%254.2194.2507.3334.3399.7同位素质谱结构鉴定、定量分析无机质谱有机质谱质谱分类质谱生命、医学、农业科学环境、地球化学、化工药学、毒物学、刑侦有机质谱法分类有机质谱仪：由于应用特点不同又分为：①气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）由于质谱仪工作原理不同，又有气相色谱-四极质谱仪，气相色谱-飞行时间质谱仪，气相色谱-离子阱质谱仪等②液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）有液相色谱-四器极质谱仪，液相色谱-离子阱质谱仪，液相色谱-飞行时间质谱仪，以及各种各样的液相色谱-质谱-质谱联用仪③其他有机质谱仪，主要有：基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪（MALDI-TOFMS），傅里叶变换质谱仪（FT-MS）气质联用仪（GC-MS）最早商品化的联用仪器适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比液质联用（LC-MS）不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物、大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图MALDI-TOFMS在测定生物大分子和合成高聚物应用方面有特殊的优越性1800多台质谱仪质谱分析原理进样系统离子源质量分析器检测器质谱仪需要在高真空下工作：离子源（10-310-5Pa）质量分析器（10-6Pa）(1)大量氧会烧坏离子源的灯丝(2)用作加速离子的几千伏高压会引起放电(3)引起额外的离子－分子反应，改变裂解模型，谱图复杂化直接进样高沸点的试液、固体样品可用探针或直接进样器送入离子源，调节温度使样品气化间接进样一般气体或易挥发样品【加热进样】色谱进样色谱-质谱联用仪器中，经色谱分离的组分通过接口元件直接导入离子源进样系统进样系统的作用是将待测物质送进离子源离子源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大对于不同的分子应选择不同的电离方法离子源是质谱仪的心脏，可以将离子源看作是比较高级的反应器，其中样品发生一系列的特征电离、降解反应，其作用在很短时间（～1μs）内发生，所以可以快速获得质谱离子源16离子源最早使用的电子轰击离子源（electronimpactsourse,EI）至今仍是使用最广泛的最重要的离子源它具有如下特点：电离效率高，灵敏度高；应用最广，标准质谱图基本都是采用EI源得到的除了电子轰击离子源外，还有化学电离源(ChemicalIonization，CI)、场致电离源(FieldIonization，FI)17电喷雾电离（ElectrosprayIonization，ESI）高压静电喷雾形成带电雾滴液滴溶剂蒸发库仑爆炸气态18大气压化学电离（AtmosphericPressureChemicalIonization，APCI）ReactionwithanalytemoleculesCoronaDischargeNeedle(NC)IonizationofsolventmoleculesMassAnalyzrX=SolventMolecueM=AnalyteAtmosphericPressureLCFlowFormationofclustersHeatedNebulizer(TEM)NebulizingGas(GS1)高温加热雾化气形成雾滴大气压下电晕针放电气相化学电离19基质辅助激光解吸电离（Matirx-assistedlaserdesorptionionization,MALDI）质子转移到生物分子或从生物分子得到质子样品分散在基质分子中并形成晶体基质从激光中吸收能量传递给生物分子20质量分析器—质谱仪的主体质量分析器的作用是将离子源产生的离子按照质荷比m/z的大小分离，使符合条件的离子飞过分析器，不符合条件的离子即被过滤掉常见的有单聚焦质量分析器，双聚焦质量分析器和四极滤质器等21检测器电子倍增器通常为光电倍增器或电子倍增器，所采集的信号经放大并转化为数字信号，计算机进行处理后得到质谱图灵敏度Sensitivity选择性Selectivity速度Speed准确度Accuracy自动化Automation可用性Application质谱特点质谱的临床应用1.临床诊断领域2.微生物诊断3.癌症和肿瘤领域4.蛋白质和多肽的定量分析•在诊断领域，随着质谱技术的发展及普及，越来越多的质谱试剂盒和设备获得批准并用于临床诊断•国家食品药品监督管理总局（CFDA）最早批准质谱技术应用于临床是在2008年•截至目前，CFDA批准的可应用于临床的质谱技术和方法共17个，其中进口厂商申报的9个，国产厂商申报的8个•质谱法被越来越多的用于生物标志物的确认，并且被公认为是临床生物标志物发现和确证的首选方法新生儿遗传代谢筛查维生素D检测激素检测血药浓度监测微量元素检测国际上已经被广泛应用的质谱临床生化项目1.新生儿遗传代谢病筛查在新生儿期对某些危害严重的先天性遗传代谢疾病进行群体筛查，并进行早期治疗，从而避免或减轻疾病的影响遗传代谢病（InheritedMetabolicDisorders，IMD）是因维持机体正常代谢所必需的某些由多肽和（或）蛋白组成的酶、受体、载体及膜泵等生物合成发生遗传缺陷而导致的疾病，多为单基因遗传病，包括氨基酸、有机酸、脂肪酸等先天性的代谢缺陷遗传代谢病病种繁多，医学界目前已发现近1000种单病发病率低，但总体发病率可达活产婴儿的1／500三、遗传代谢病的临床危害据卫生部发布的《中国出生缺陷防治报告(2012)》显示：中国出生缺陷发生率约为5.6%每年新增出生缺陷数约90万例占世界的20%我国自上世纪80年代初期开展的新生儿遗传代谢病筛查主要包括：先天性甲状腺功能减退症苯丙酮尿症先天性肾上腺皮质增生葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症等传统的新生儿筛查•一次实验只能检测一种疾病•多种疾病需要多次检测•1990年美国杜克大学Dr.Millington提出用串联质谱(MS/MS)技术进行新生儿筛查，通过检测血液样品中各种氨基酸、酰基肉碱的浓度来诊断多种氨基酸、有机酸、脂肪酸异常疾病•使用串联质谱技术利用一份血样即可在几分钟内检测数十种氨基酸、有机酸、脂肪酸代谢紊乱的疾病美、欧、日等国家都已经使用串联质谱技术对多个代谢产物进行联合检测，同时筛查超过30种疾病•串联质谱技术实现了“一项实验检测一种疾病”向“一项实验检测多种疾病”的转变，提高了检测的效率•使筛查过程中常见的假阳性或者假阴性的发生率显著降低•采用干血点作为检材，用血量少，易采集、保存、运输•使新生儿疾病筛查在内容和质量上都提高到一个新的水平•我国串联质谱技术的推广和普及在初期较欧美国家稍慢，但近几年也得到了很快的推广•国内已有10多个省份陆续开展了采用串联质谱进行新生儿疾病筛查的工作•很多二、三线城市的有关医疗机构也相继引进并推广该项技术的应用2.维生素D检测脂溶性维生素固醇类衍生物(类固醇激素)部分天然食物紫外线照射目前维生素缺乏已经成为一个全球性问题体内维生素D含量的检测受到了更多的关注•体内维生素D的主要代谢形式•包括25（OH）D2和25（OH）D3两种形式•其含量可以代表体内维生素D的水平25-羟基维生素D目前临床常用的维生素D检测方法有•维生素D结合蛋白分析法•放射免疫分析法•酶联免疫法•免疫化学发光法•高效液相色谱法（HPLC）•液相色谱—质谱法（LC-MS/MS）•酶免法在自动化操作、节省人力方面具有一定的优势，适合于常规临床实验室开展•酶免法不足之处在于特异性低，对基质效应敏感，容易与其他非目标化合物产生交叉反•HPLC的不足之处是分析时间长、检测通量小、灵敏度低、所需样品量大目前商业化的免疫学方法•无法满足临床要求，方法间一致性较差，可能的原因在于各检测平台对25（OH）D2和25（OH）D3检测能力和区分效率不同，易产生交叉反应•结合蛋白会引起免疫学方法间25（OH）D定量差异；且结合蛋白浓度越高，差异越大2010年，来自临床和实验室的专家们共同推荐25（OH）D的检测方法应能同时检测出25（OH）D2和25（OH）D3，以保证来源于植物或动物的维生素D补充均能够被检测出特异性更好和抗干扰性更强能实现25-(OH)-VD2和25-(OH)-VD3同时测定有利于临床医生对行25-(OH)-VD治疗患者进行动态浓度监测质谱法测定25-(OH)-VD3.激素检测激素检测在临床化学领域最具有挑战性：（1）许多激素具有相似的化学结构（2）浓度低，有结合、游离之分（3）对于某些复杂的疾病，由于代谢通路障碍，需要同时检测多种激素对类固醇激素及其代谢产物的检测是质谱技术在临床生化检验中一个非常重要的项目•免疫学方法作为睾酮的常规检测方法，基本能满足临床对正常男性体内高浓度睾酮水平检测的需求•但缺乏对部分男性性腺功能减退、女性和儿童体内低浓度睾酮水平的检测能力ClinicalChemistry刊登Herold等的社论指出：与其用免疫学方法评估女性体内的睾酮水平，不如猜测来得更准确、更快捷、且对患者无创伤2014年美国内分泌学会发表声明，宣布2015年开始将只接受由质谱方法检测的研究结果(1)检测范围：质谱法检测限值显著低于免疫学方法(2)检测精密度：2011年CAP调查显示:大多数实验室采用免疫学方法检测雌二醇一项多中心长期研究显示，免疫学方法检测低浓度雌二醇的CV高达28.4％，无法满足对绝经女性评估的临床需求(3)检测特异性和准确性：比利时的一次室间质量评价计划将140个实验室现有免疫学方法检测的雌二醇结果与LC-MS/MS进行比较，结果发现雌二醇浓度越低，偏倚越大，最高可达23.9％上述挑战有助于临床实验室推动LC-MS/MS的建立和发展，尤其对于男性、儿童和绝经后女性患者。以检测灵敏度为例，LC-MS/MS检测限值为4ng/L，功能灵敏度可达0.2ng/L，而免疫学方法功能灵敏度接近20.0ng/L，前者更能满足临床的需求目前利用质谱技术可以对•睾酮•脱氢睾酮•雄酮、雌酮•雌二醇•雌三醇•皮质醇•醛固酮•可的松多种激素进行定量检测，进而对相关疾病进行临床诊断和治疗，如先天性肾上腺增生症、原发性醛固酮增多症等4.血药浓度监测在临床疾病治疗中，很多药物的浓度需要严格限定在某一合适范围，过少达不到治疗效果，过多则可能引起毒性或成瘾反应，造成不良后果目前国际上已经在临床开展的药物浓度监测项目1、易成瘾性的药物，如免疫抑制剂，精神类药物，抗抑郁药物及抗肿瘤药物2、应用治疗指数低、安全范围小、不良反应强、无明确判断指标的药物，如地高辛3、应用具有非线性药代动力学特征的药物和药代动力学个体差异大的药物，如阿司匹林、双香豆素、保泰松等4、多种药物联合用药时主要方法包括•传统免疫学方法•光谱法•色谱法【液相色谱紫外检测法和液相色谱串联质谱检测法（LC-MS/MS）】•免疫学法和LC-MS/MS法是主流方法•免疫学方法虽简单易行，但只能检测少数几种药物；一次实验只能检测一种化合物•对于联合用药，一个样本则需要进行多次实验•一般药物在体内的浓度都很低，要求检测方法具有高灵敏度•由于小分子药物和药物代谢物结构相似，抗体很难区分原型药物和代谢物，会同时与原型和代谢物相结合，造成检测结果偏高•近年来质谱技术逐渐成为药物浓度检测的重要手段•多种药物均可以利用质谱技术进行准确检测•且可以实现多药物同时检测，提高了临床检测工作的效率•随着质谱技术的不断发展和完善，其有