流式细胞分选服务注意事项-浙江大学肿瘤研究所

1浙江大学肿瘤研究所流式细胞分选实验注意事项一、仪器简介BDFACSAriaII流式细胞分选仪，现配备3个激光器（488nm、633nm和375nm），11个探测器，获取速度达70,000细胞/秒，分析速度达50,000细胞/秒，理论分选纯度大于98%，CV值小于2.0%，喷嘴可选择85mm或100mm，进样管和收集管可选择12*75mm流式管或15ml离心管，可两管或四管分选，配备BDACDU装置，可以在微孔板上定量分选细胞。二、预约方式与收费标准影响流式细胞分选成功与否的因素较多，在上机时曾发生荧光抗体选择不正确无法区分、细胞未处理成单细胞悬液堵塞管路、未做预实验无法找到待分选细胞群等情况，为避免浪费宝贵的样品和上机时间，请仔细阅读本注意事项，不明之处请联系管理员。按照研究所规定，请先预缴费用，到账后预约上机，具体流程如下。1.校内用户实验流程：（a）确定本仪器能否满足实验要求，可使用在线工具SpectrumViewer确定荧光种类是否合适；（b）确定预缴费用，由管理员开具“医学院肿瘤学重点学科平台大型仪器有偿服务平台测试清单”，凭清单去财务处办理转账（5000元以上请向管理员索取测试报告，10000元以上需提供合同）；（c）费用到账后联系管理员预约上机时间（提前一周左右）；（d）按预约时间上机完成分选，上机人员签三联单确认费用，如超出预缴费用则需开具测试清单补缴费用，如有结余可用于下次实验。2.校外用户实验流程：其他流程同校内用户，发票在到账后联系管理员开具。3.取消预约：最迟于预约时段前一天电话取消预约。4.上机时间：周一至周五下午1:30-5:00。5.上机地点：杭州解放路88号浙江大学医学院附属第二医院门诊楼1208室6.联系方式：葛维挺[e-mail]0571-87784606杭州解放路88号浙江大学医学院附属第二医院门诊楼1303室7.收费标准：按《浙江大学大型仪器设备有偿服务管理办法》，流式细胞分选：校内800元/小时，校外1200元/小时。收费由预约时间起，按半小时为单位计。请谨慎预估时间，超时15分钟视同放弃上机。2三、特别注意1.安全性问题：由于在分选过程中，样本可能通过液滴震荡产生气溶胶，所以不接受会传播人类病原菌的生物有害样本，也不接受含放射性生物样品。2.应知道细胞的大小与形态，以便选择分选用喷嘴。所分选细胞的直径最好小于喷嘴直径的1/5，至少小于1/3。细胞的形态也会影响了分选的结果，理论上越接近于球形的细胞，分选过程中的剪切力对细胞造成的伤害就越小。形态特殊的细胞应选择较大的喷嘴，以减轻分选过程对细胞造成的伤害。各种细胞的建议浓度和所用喷嘴如下表。Table1细胞种类和浓度、喷嘴的选择细胞种类浓度喷嘴Lymphocytes,thymocytesorsplenocytes(直径8-12μm)8-12×106/ml85μmActivatedlymphocytes,smallercelllines(直径12-20μm)7-9×106/ml85μmLargeadherentcellline(直径20μm)5-8×106/ml100μm3.荧光染料的选择：如选择1到4个荧光标记，一般按如下顺序选择，FITC、PE、APC和PerCP。四、样本制备1.样本制备基本流程：获取细胞悬液→荧光抗体染色→调整细胞浓度（参考Table1）→避光置冰上运至分选室→移入带过滤头的流式管→上机检测并设定分选条件→试分选并上机检测纯度→分选细胞。2.分选所用的细胞染色方法与分析所用方法基本相同，但需要注意以下几点：a）保证样本的无菌状态，因为分选得到的细胞还要继续培养b）不同使用固定剂固定细胞，因为活细胞经固定剂处理后即死亡c）保证上机样品为单细胞悬液（我们提供带过滤头流式管(FalconCat#352235））d）准备充足的细胞，详见FAQ3e）分选缓冲液使用含2%FBS或BSA的PBS，普通培养基中的酚红可能会干扰分选f）如细胞分选后需再次培养，请准备含血清的收集管，在分选前交操作员。建议在15ml离心管中加入1-2ml血清及其它必需组分，保证分选完毕时血清浓度大于5%g）如要分选GFP等转染的样品，请提供未经转染的相同细胞为阴性对照h）如要做多重荧光染色标本的分选，请提供各种单一荧光染色的标本i）如要去除死细胞，在不影响后续实验前提下，可以加入7-AAD或是PIj）快速简便的样本处理有利于分选：处理好的样本尽快上机，分选好的细胞尽快下一步实验，如果要分选多个样本，建议一次处理一个，估计可能的上机时间后，再处理第二个样本3五.常见问题Q1.上机样品需要溶在何种溶液中？是否可以就直接放在原本培养的培养基中？Ans:建议不要放培养基中，因为PhenolRed可能会影响分选的结果，可先尝试使用含2%FBS或BSA的PBS作为分选缓冲液。如要求更好的细胞存活率，按分选细胞的不同，选择不同的分选缓冲液。1.淋巴细胞（HBSS配方中的阳离子可增进细胞的生存力。如果这些细胞并非易于群集细胞，可以选用没有EDTA的缓冲液）。a)1mMEDTA,25mMHepes(pH7.0)and0.5%-2%BSAin1×PBS(withoutCa2+andMg2+)b)1×HBSS(withoutphenolred)with1%BSAc)0.5%-2%BSAinPBS(withoutCa2+andMg2+)2.贴壁细胞（以Trypsin处理后去准备单细胞悬浮液时，待细胞变圆(切记不可过度作用)，以适量含5%血清培养液收取细胞，并均匀地打散细胞悬浮液。离心后，用分选缓冲液调整细胞浓度。如果需要的话可以提高EDTA的浓度(至5mM)以避免细胞重新黏聚）。a）5mMEDTA,25mMHepes(pH7.0)and0.5%-2%BSAin1×PBS(withoutCa2+andMg2+)b）0.5-2%BSAinPBS(withoutCa2+andMg2+)3.含有高比例死细胞的样本（这些配方可减少因死细胞释放出来的DNA所造成的细胞黏聚现象。）5mMMgCl2,1mMEDTA,25mMHepes(pH7.0),25-50μg/mLDNAaseIand0.5%-2%BSAin1×PBS(withoutCa2+andMg2+)4.建议询问有经验者（使用相同细胞进行过分选）的分选缓冲液配方Q2.如果细胞要再培养，会污染吗？Ans:分选所用的所有溶液都经高温高压灭菌，流式分选仪管路使用70%乙醇定期清洗，仪器所在房间在每次分选前紫外灭菌，最后在细胞培养基中加入抗生素，可将污染机率降至很低。Q3.如果我想在分选后拿到1×106的细胞我应该一开始准备多少细胞去做分选？Ans:假设你要的细胞只占总数的10%，则你所需准备的细胞数如下公式:1×106=10%×50%回收率×20×106(起始细胞数)，所以你需要准备2×107细胞。高速分选、纯度模式(purityvs.yieldmode)、部分细胞黏附于上样管壁、部分细胞用于样本分析、长时间分选过程中细胞的死亡等等，对会降低回收率。50%回收率是一个一般的参考值。Q4.通常做一次细胞分选需要多久时间？Ans:分选的过程有三个步骤，分别为设定分选区域、分选及分选后的分析。设定分选区域约需15-20分钟。分选的时间决定于细胞数目，虽然机器的分选速度最高可达70,000细胞/sec，但为得到最佳分选结果，4我们通常设定分选速度为10,000-20,000细胞/秒。因此，如欲分选2×107细胞，其所需分选时间约为17-34分钟。分选后约需15-20分钟去分析及打印结果。所以，总共约需1-1.2小时去分选2×107细胞。Q5.一个样品可以同时分选出几种细胞?Ans:FACSAria可以从一个样品中最多同时分选出四种不同的细胞。Q6.可以同时使用多少参数进行细胞分选？Ans:FACSAria最多可以根据15个参数去定义及分选一群细胞(检测488nm激光对应的5种荧光信号及SSC和FSC，监测633nm激光对应的2种荧光信号，检测375nm激光对应的2种荧光信号，另有四个可扩充的空白通道)。Q7.分选后细胞的纯度有多少？Ans:通常可以达到95%以上的纯度，如果所分选细胞可以和其他细胞群较好的区分。Q8.如果阳性的细胞占总数的1%以下，还可以做分选吗？Ans:可以，但是低含量细胞的分选会导致低纯度及低回收率。因此，我们建议使用者事先富集你感兴趣的细胞。细胞富集的方式可以是正选：如用磁珠法富集你感兴趣的细胞；也可以是负选，如利用nylonwool去除B细胞，或磁珠法去除不要的细胞。Q9.分选时所使用的管子有哪些？Ans:上样一般使用我们提供的带滤网5ml流式管；收集可以使用下面这三种管，15ml离心管(最多双路分选)，5ml带盖流式管(Falcontube#352003)(最多四路分选)，或1mlMicrotube(最多四路分选)。Q10.可不可以把分选后的结果文件带走？Ans:可以，提供FCS3.0格式的流式分析结果，请提供邮箱以便邮件发送，进一步分析可使用免费软件WinMDI或商业软件Flowjo和FCSExpress软件。