JJF 2055-2023 数字聚合酶链反应分析仪校准规范

中华人民共和国国家计量技术规范JJF2055—2023数字聚合酶链反应分析仪校准规范CalibrationSpecificationforDigitalPolymeraseChainReactionAnalyzers2023-06-30发布2023-12-30实施国家市场监督管理总局发布数字聚合酶链反应分析仪校准规范CalibrationSpecificationforDigitalPolymeraseChainReactionAnalyzers􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀥣􀧣􀧣􀧣􀧣JJF2055—2023归口单位:全国生物计量技术委员会主要起草单位:中国计量科学研究院参加起草单位:南京市计量监督检测院中国测试技术研究院本规范委托全国生物计量技术委员会负责解释JJF2055—2023本规范主要起草人:董莲华(中国计量科学研究院)王晶(中国计量科学研究院)高运华(中国计量科学研究院)参加起草人:王尚君(南京市计量监督检测院)陈鸿飞(南京市计量监督检测院)周李华(中国测试技术研究院)JJF2055—2023目录引言(Ⅱ)………………………………………………………………………………………1范围(1)……………………………………………………………………………………2引用文件(1)………………………………………………………………………………3术语和计量单位(1)………………………………………………………………………3.1数字PCR(1)…………………………………………………………………………3.2数字PCR仪(1)………………………………………………………………………3.3拷贝数(1)………………………………………………………………………………3.4拷贝数浓度(1)…………………………………………………………………………4概述(2)……………………………………………………………………………………5计量特性(2)………………………………………………………………………………6校准条件(3)………………………………………………………………………………6.1环境条件(3)……………………………………………………………………………6.2测量标准及其他设备(3)………………………………………………………………7校准项目和校准方法(3)…………………………………………………………………7.1校准条件(3)……………………………………………………………………………7.2温度示值误差、温度均匀性校准(3)…………………………………………………7.3升降温速率校准(5)……………………………………………………………………7.4拷贝数浓度示值相对误差校准(6)……………………………………………………7.5拷贝数浓度重复性校准(7)……………………………………………………………7.6荧光强度重复性(8)……………………………………………………………………7.7反应单元个数重复性(8)………………………………………………………………8校准结果表达(8)…………………………………………………………………………8.1校准结果处理(8)………………………………………………………………………8.2校准证书(8)……………………………………………………………………………8.3校准结果的测量不确定度(9)…………………………………………………………9复校时间间隔(9)…………………………………………………………………………附录A标准物质和荧光溶液配制及使用(10)……………………………………………附录B反应体系的配制(11)………………………………………………………………附录C校准原始记录参考格式(12)………………………………………………………附录D校准证书(内页)参考格式(14)…………………………………………………附录E拷贝数浓度示值相对误差的不确定度评定示例(16)……………………………附录F温度示值误差校准结果的不确定度评定示例(19)………………………………ⅠJJF2055—2023引言JJF1071《国家计量校准规范编写规则》、JJF1001《通用计量术语及定义》和JJF1059.1《测量不确定度评定与表示》共同构成支撑本规范制定工作的基础性系列规范。校准方法及计量特性等主要参考了JJF1527《聚合酶链反应分析仪校准规范》、YY/T1173《聚合酶链反应分析仪》和ISO20395:2019《生物技术—核酸目标序列定量方法性能评估要求—qPCR和dPCR》(Biotechnology—Requirementsforevaluatingtheperformanceofquantificationmethodsfornucleicacidtargetsequences—qPCRanddPCR)。本规范为首次发布。ⅡJJF2055—2023数字聚合酶链反应分析仪校准规范1范围本规范适用于微滴式、芯片式和微孔式数字PCR(PloymeraseChainReaction)仪计量性能的校准,对于其他类型的数字PCR仪,可参照本规范执行。2引用文件本规范引用了下列文件:JJF1527聚合酶链反应分析仪校准规范YY/T1173聚合酶链反应分析仪ISO20395:2019生物技术—核酸靶序列定量方法的性能评价要求—qPCR法和dPCR法(Biotechnology—Requirementsforevaluatingtheperformanceofquantificationmethodsfornucleicacidtargetsequences—qPCRanddPCR)凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本规范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本规范。3术语和计量单位3.1数字PCRdigitalPCR,dPCR将核酸模板分布在多个等体积的反应单元,每个反应单元中包含或不包含一个或多个拷贝的靶序列(核酸模板),对靶序列进行PCR扩增,并对特定的PCR产物进行检测,再根据阳性微滴的比例以及泊松分布原理,计算出靶序列的浓度或拷贝数。注1:假设在分割过程中,核酸靶序列是随机且独立地分布在各个反应单元中。注2:阳性分割和阴性分割的计数通常在热循环反应后对PCR产物的终点检测,也有一些dPCR平台可以对PCR产物进行实时qPCR监测。[ISO20395:2019,3.10]3.2数字PCR仪digitalPCRanalyzer基于PCR技术原理,模拟DNA或RNA复制过程,在核酸模板、引物、聚合酶等存在的条件下,将核酸模板分布在多个反应单元中,特异扩增已知序列,对扩增后的荧光信号进行检测分析的仪器设备。3.3拷贝数copiesnumber包含特定核酸序列的分子数。[ISO20395:2019,3.6]3.4拷贝数浓度copiesnumberconcentration[ISO20395:2019,3.7]单位体积中包含特定核酸序列的分子数。注:以copies/μL为计量单位。1JJF2055—20234概述数字PCR仪(以下简称dPCR仪)是通过微流控技术将核酸样本与PCR反应试剂混合液分布在多个反应单元内,进行PCR扩增,通过荧光检测器读取扩增后每个反应单元的荧光信号强度来判断含有目标核酸分子(阳性反应)的单元的个数(P),基于泊松分布,根据反应单元的个数(N)、每个反应单元的体积(VP)以及稀释因子(D),可计算出样本中的核酸分子数,从而实现对核酸拷贝数浓度(T)的绝对测量[见公式(1)]。微滴式dPCR仪由微滴生成仪、PCR扩增仪、微滴阅读器3部分组成。芯片式和微孔式dPCR仪由加样器、热循环/检测器两部分或加样器、PCR扩增仪和芯片阅读器3部分组成。核酸拷贝数浓度按公式(1)计算:T=-DVP×ln1-PN(1)式中:T———核酸拷贝数浓度,copies/μL;D———稀释因子;VP———每个反应单元的体积,μL;P———含有目标核酸分子(阳性反应)的反应单元的个数;N———反应单元的个数。5计量特性计量特性见表1中的规定。表1dPCR仪计量特性及指标序号计量特性计量特性指标1温度示值误差±1.0℃2温度均匀度≤2.0℃3升温速率(50~90)℃≥0.8℃/s4降温速率(90~50)℃≥0.8℃/s5拷贝数浓度示值相对误差±30%6拷贝数浓度重复性≤10%7荧光强度重复性≤10%8反应单元数重复性≤30%注:对于芯片式数字PCR荧光强度重复性、反应单元数重复性不做校准。以上指标不用于合格判别,仅供参考。2JJF2055—20236校准条件6.1环境条件6.1.1环境温度为(15~30)℃,相对湿度不大于80%。6.1.2实验室环境应满足仪器安装的要求,不得存在强烈的机械振动和电磁干扰。注:上述条件与制造商的产品规定不一致时,以产品规定为准。6.2测量标准及其他设备6.2.1标准物质:校准时应采用经计量行政部门批准发布的、非单一数字PCR原理的方法定值的DNA拷贝数浓度标准物质。其特性量值拷贝数浓度104copies/μL,相对扩展不确定度≤8%(k=2)满足校准需求。6.2.2荧光强度重复性校准溶液:羧基荧光素(FAM)通道校准荧光溶液激发波长范围为450nm~495nm,发射波长范围为515nm~530nm,六氯荧光素(HEX/VIC)通道校准荧光溶液激发波长范围为515nm~535nm,发射波长范围为550nm~580nm。校准前按照附录A配制校准时使用的溶液。6.2.3PCR引物和探针序列:本规范推荐使用与6.2.1标准物质匹配的引物和探针序列。6.2.4温度校准装置:由若干个(通常为15个、12个、5个)精密温度传感器、数据采集分析模块组成,测温范围为(0~120)℃,温度校准装置测量不确定度≤0.1℃(k=2)。采集频率≥1.5次/秒。6.2.5移液器:规格为10μL、100μL、200μL、1000μL。6.2.6超纯水:电阻率≥18.2MΩ·cm(25℃)。7校准项目和校准方法7.1校准条件校准前需将dPCR仪开机预热30min,确保仪器达到正常工作状态。7.2温度示值误差、温度均匀性校准7.2.1将dPCR仪及温度校准装置各部件连接完好,在温度传感器表面上涂抹适量导热油,依据dPCR仪器型号和加热模块形状不同,按图1、图2、图3所示将温度传感器置于dPCR仪加热模块设定位置(孔),其中图1为15个独立的测温探头(A1、A4、A7、A10、A12、D1、D7、D12、E4、E10、H1、H4、H7、H10、H12),图2为12个独立的测温探头(A1~A4、B1~B4、C1~C4),图3为5个独立的测温探头(A、B、C、D、E)。其他型号的dPCR仪可参照图1、2、3排布进行校准。3JJF2055—2023图196孔加热模块温度传感器排布示意图图212个平板加热模块温度传感器排布示意图图3单个平板加热模块温度传感器排布示意图4JJF2055—20237.2.2参照送校单位提供的dPCR仪说明书设定温度控制程序,如表2所示(如不能设置30℃,温控程序参考表2执行)。表2dPCR仪温度控制程序标准程序表步骤设定温度点/℃设定温度持续时间/min130129533302490355036703760383017.2.3启动温度校准装置,记录整个数据采集过程并保存。7.2.4温度示值误差校准结果按公式(2)和公式(3)计算:ΔTd=Ts-Tc(2)Tc=1n∑ni=1Ti(3)式中:ΔTd———温控装置工作区域内温度示值误差,℃;Ts———温控装置工作区域内设定温度值,℃;Tc———所有测温传感器测量值的平均值,℃;Ti———设定温度点,稳定时间不少于10s期间的第i个温度传感器记录值,℃。7.2.5温度均匀度校准结果按公式(4)计算:ΔTu=Tmax-Tmin(4)式中:ΔTu———温度均匀度,℃;Tm