MLST方法原理、数据处理及应用介绍

MLST方法原理及应用介绍中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室周海健ICDC,ChinaCDC分型方法分辨力分型力可重复性可比性操作难易程度一次实验周期实验通量实验费用*核糖体分型（Ribotyping）好好好中等一般一天小低随机扩增PCR（RAPD）一般好一般中等容易一天大低扩增片段长度多态性（AFLP）较好较好好中等一般两天中等中等多位点序列分型（MLST）一般好好好一般两天大高脉冲场凝胶电泳（PFGE）较好较好较好较好一般两天小中等多位点串联重复序列（MLVA）较好较好较好较好一般一天大低常用细菌分子分型方法的比较ICDC,ChinaCDC分子分型主要的三种实验数据形式1.图像数据：脉冲场凝胶电泳（PFGE)随机扩增多态性DNA分析（RAPD)扩增片断长度多态性分析（AFLP）核糖体分型（Ribotyping）2.分类数据：多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）多位点序列分析（MLST）单碱基核苷酸多态性分析（SNP）3.序列数据：全基因测序特异基因、基因簇测序（如军团菌的mip基因测序、脑膜炎奈瑟菌的PorA和FetA分型、16srRNA基因测序）ICDC,ChinaCDC分型的三个层次相似度比较（Pairwisesimilarities）种群结构分析（Populationmodelling）遗传进化关系分析（Evolutionarymodelling）ICDC,ChinaCDCPFGE:引起两株细菌分型数据不同的遗产事件MLVA：VNTR位点滑链突变MLST：管家基因的点突变1.大片段的插入、缺失、重组等2.酶切位点的点突变3.质粒的获得、丢失ICDC,ChinaCDCMLST基本原理菌株编号abcZadkaroEfumCgdhpdhCpgmMLST型NM20110111213219ST-7NM2011022343846ST-11NM2011032343846ST-11NM201104222358275305255ST-4821细菌染色体abcZ测序结果123222222222ICDC,ChinaCDCDNA提取管家基因扩增分离鉴定标本采集可靠的序列MLST分型流程序列分析纯菌培养测序构树ICDC,ChinaCDC（1）已分离到细菌：细菌培养，提取DNA。用试剂盒或者水煮法提取均可以。（2）未分离到细菌的标本（脑脊液、血液、咽拭子、肺泡灌洗液等）：用标本直接提取细菌DNA，只能用试剂盒提取。DNA提取脑膜炎奈瑟菌MLST数据库流感嗜血杆菌MLST数据库嗜肺军团菌SBT（MLST）分型数据库网站提交获得分型结果沙门氏菌MLST数据库ICDC,ChinaCDCMLST结果•MLST适合用于长期的、大范围的流行病学调查和监测菌群结构变化，研究地域性传播和流行性变迁。•管家基因序列的变化速率慢，多态性相对于其他基因组分更小，目前认为MLST不能单独作为暴发溯源的工具。•两株细菌MLST分型结果相同，表示这两株细菌属于相同的克隆或者克隆群，不能认为他们之间有流行病学联系。2005-2012年234株脑膜炎奈瑟菌MLST分析MLST应用实例一：脑膜炎奈瑟菌种群结构现状分析1956-2012年流脑主要血清群流行菌株分子型别变迁MLST应用实例二：脑膜炎奈瑟菌菌群变迁MLST应用实例三：环境军团菌菌群结构分析2005-2012年中国7个城市环境分离164株血清1型嗜肺军团菌种群结构特征ICDC,ChinaCDC中、日、韩三国环境分离血清1型嗜肺军团菌种群结构特征ICDC,ChinaCDCMLST应用实例四：霍乱弧菌菌群结构特征分析160株O1群霍乱弧菌MLST分析最小生成树160株O1群霍乱弧菌MLST分析Neighbor-joining树ICDC,ChinaCDCMLST应用实例五：副溶血弧菌菌群结构特征分析ICDC,ChinaCDC谢谢无法区分：分离株有相同的带型，包括条带的数目和位置。这些分离株为同一菌株。高度相关：如果PFGE带型仅有因一次基因事件引起的带型变化，这些菌株就被定义为高度相关菌株。这些仅有两到三个条带变化的情况常见于反复传代以及从同一病人中多次分离的菌株。可能相关：PFGE带型与爆发菌株带型变化有两个独立的基因事件引起的条带变化。（通常是4到6个条带的变化）。这些分离株可能是遗传上相关的，但是并不是紧密相关的，其流行病学关系也并不紧密。这样的突变常见于分离自较长的时间段（大于等于6个月）或者是大规模延伸爆发的病人中。无关：三个独立的基因事件引起的条带变化（7个或者是以上的条带变化）。PFGE结果判读：TENOVER原则TENOVER原则的前提：菌株是同一暴发期间分离的关于分型方法使用的建议•暴发调查所有菌株进行PFGE，挑选代表菌株进行MLST；对于细菌特异性引物PCR扩增阳性的标本未能分离菌株的，进行MLST分型。•个案调查所有菌株进行PFGE和MLST分型；对于细菌特异性引物PCR扩增阳性的标本未能分离菌株的，进行MLST分型。•全国范围的、长期的流行情况调查所有菌株进行PFGE，挑选代表菌株进行MLST分型。肺炎克雷伯菌院内感染鉴别ST-11暴发相关菌株健康携带本底菌株健康携带本底菌株流脑暴发调查流脑菌株总携带率：28.3％暴发相关菌株携带率：15.7%谢谢