胞内因子染色-protocol

BD胞内因子染色操作流程本流程适用的固定破膜试剂盒：全称组分简称货号BDCytofix/Cytoperm™Fixation/PermeabilizationKit1、Fixation/Permeabilizationsolution(125ml)2、BDPerm/Wash™Buffer,10×含FBS及皂角苷(100ml)(使用前双蒸水1：9稀释为1x)固定破膜试剂盒554714BDCytofix/Cytoperm™PlusFixation/PermeabilizationKit(withBDGolgiStop™)1、Fixation/Permeabilizationsolution(125ml)2、BDPerm/Wash™Buffer,10×含FBS及皂角苷(100ml)(使用前双蒸水1：9稀释为1x)3、BDGolgiStop蛋白转运抑制剂，含莫奈霉素（可单独销售，货号：554724）（0.7ml）增强型固定破膜试剂盒（含蛋白转运抑制剂）554715BDCytofix/Cytoperm™PlusFixation/PermeabilizationKit(withBDGolgiPlug™)1、Fixation/Permeabilizationsolution(125ml)2、BDPerm/Wash™Buffer,10×含FBS及皂角苷(100ml)(使用前双蒸水1：9稀释为1x)3、BDGolgiPlug蛋白转运抑制剂，含BSA（可单独销售，货号：555029）（1.0ml）固定破膜剂（含蛋白转运抑制剂）555028实验流程：A.刺激细胞：体外刺激细胞因子的产生有很多种方法。多克隆抗体激活剂在诱导细胞因子产生过程中尤为重要。此类激活剂主要包括以下物质：佛波酯加钙离子载体或离子霉素，植物凝血酶，葡萄球菌肠毒素B，以及直接针对TCR/CD3复合物的单克隆抗体（加或不加针对共刺激受体如CD28的抗体）注意：已报道单独的PMA刺激会导致小鼠T细胞表面CD4的表达降低。PMA与钙离子载体共同刺激则使CD4表达降低更多，同时也会导致小鼠CD8胸腺细胞及小鼠和人外周血T淋巴细胞减少。1.）使用BDGolgiStop™蛋白转运抑制剂（含莫奈霉素）的操作步骤每6ml细胞培养基中加入4μlBDGolgiStop™并充分混匀。BDGolgiStop™在培养基中不应超过12小时。2.）使用BDGolgiPlug™（含布雷菲德菌素A）蛋白转运抑制剂（含BSA）的操作步骤每1ml细胞培养基中加入1μlBDGolgiPlug并充分混匀。BDGolgiPlug在培养基中不应超过12小时。BDGolgiPlug™中含有DMSO，4°C时会结晶为固体。B.样本处理：细胞表面及胞内因子的多色染色1.细胞培养用蛋白转运抑制剂体内刺激组织样本或者体外刺激培养基细胞以制备活的细胞群。细胞分离后重悬于染色培养基中，计数并转移至免疫荧光染色的塑料管或微孔板中。在染色及储存过程中细胞需避光保存。2.阻断Fc受体阻断Fc受体的试剂可降低非特异性免疫荧光染色。a．小鼠中，用特异性针对FcγII/III受体的2.4G2纯化抗体（BDFcBlock™，货号：553142）封闭荧光抗体Fc受体引起的非特异性染色。在100μlStainingBuffer（货号：554656）中加入1μgBDFcBlock/10^6细胞，4°C孵育15分钟。随后清洗细胞，加入细胞表面抗原的特异性荧光抗体（提前用stainbuffer适当稀释）。b.对于人类细胞，可提前将细胞与人血清或过量的同种属不相关纯化Ig共同孵育，并加入同型对照以阻断Fc受体。c.大鼠中，用特异性针对FcgII受体的D34-485纯化抗体（BDFcBlock™，货号：550270或550271）阻断荧光抗体Fc受体介导的非特异性结合。10^6细胞重悬于100μlStainingBuffer（货号：554656）中，加入1μgBDFcBlock，4°C孵育15分钟。随后清洗细胞，加入细胞表面抗原的特异性荧光抗体（提前用stainbuffer适当稀释）。3.细胞表面染色a．用50μlStainingBuffer重悬10^6细胞，加入适量的特异性单克隆荧光抗体，如CD3，CD4，CD4，CD14，CD19等，4°C孵育30分钟。b.加入适量StainingBuffer清洗细胞2次(微孔板250μl/次，试管1ml/次)，250g离心细胞。4.细胞固定、破膜a.充分重悬细胞，加入适量（微孔板100μl/孔，试管250μl/管）Fixation/Permeabilizationsolution，4°C孵育20分钟。注意：加入Fixation/Permeabilizationsolution之前vertex振荡混匀以避免细胞聚集b.用1×BDPerm/Wash™buffer清洗细胞2次(微孔板250μl/次，试管1ml/次)5.（选择性）细胞固定、破膜细胞固定后可保存一段时间继续染色a.细胞固定与保存1.）100μl4%多聚甲醛（或1ml/10^7细胞）重悬细胞，4°C孵育10-20分钟。2.）StainingBuffer清洗细胞2次.3.）StainingBuffer重悬细胞，4°C保存72小时；或用90%FCS/10%DMSO重悬细胞，-80°C长久保存。b.对已固定的细胞进行破膜1.）对于冻存细胞，清洗2次去除DMSO。对于4°C保存的细胞，离心后去除stainingbuffer。2.）将细胞重悬于BDPerm/Wash™buffer，孵育15分钟。3.）离心去上清。4.）胞内因子染色。6.胞内因子染色a.取适量细胞因子荧光抗体或阴性对照，用BDPerm/Wash™buffer稀释至50μl。用此抗体稀释液充分重悬已固定破膜的细胞，4°C避光孵育30分钟。b.1×BDPerm/Wash™buffer（微孔板250μl/次，试管1ml/次）清洗细胞2次，然后用StainingBuffer重悬，上流式细胞仪检测。