Q-PCR讲解..

唯我所欲、精准溯源—qPCR实验解析北京全式金生物技术有限公司2•qPCR技术•绝对定量VS相对定量•一步法VS两步法qRT-PCR概述•核酸提取•cDNA合成(两步法qRT-PCR)•引物设计方法和原则样品准备•必要的对照、内参、标准•选择相应的荧光检测方法•试剂选择实验设计•分析扩增曲线、溶解曲线和标准曲线•实验常见问题分析数据分析3qPCR基本概念4常规PCR与实时荧光定量PCR•常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析•实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终对起始模板进行精确的定量分析5荧光定量PCR仪器工作原理•激发光发射源•接收装置•PCR反应模块qPCR参数:扩增曲线扩增曲线、标准曲线反映qPCR重要指标qPCR参数:溶解曲线溶解曲线(下左):温度和荧光值的关系，在扩增结束后进行处理后溶解曲线(下右):温度和荧光值的关系，并取其导数，更为常用应用:指示特异性，最为理想的为单峰；如出现多峰证明反应不特异或存在引物二聚体确认反应特异性，增加数据可信度qPCR的数学原理•理想的PCR反应：Xn=X0×2n•非理想的PCR反应：Xn=X0(1+Ex)n•方程式两边同时取对数得:logXn=log(X0(1+Ex)n)整理方程式得:logX0=(-log(1+Ex))×n+logXn•将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：logX0=(-log(1+Ex))×C(t)+logXc(t)初始浓度的对数与循环数呈线性关系n：扩增反应的循环次数Xn：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率9MIQEqPCR国际标准1.提出发表文章时所要求的最低限度的必要信息标准。2.对qPCR的术语；概念；研究与临床应用；样本的采集、处理和制备；核酸的质量控制；反转录；qPCR过程；数据分析等方面的操作标准和规范都做了详尽的阐述。10qPCR常用定量方式qPCR常用实验方法•TaqMan®/TaqMan-MGB®•MolecularBeacon•SYBRGreenI•MGBEclipseTMProbes•ScorpionsTM•Others...qPCR常用实验方法简单成本较低适用于多重PCR特异性较好可进行SNP检测特异性非常好荧光标记方法选择•医疗检验–TaqMan探针法•特异•准确•科研–SYBR方法•便宜•方便–TaqMan探针法•要求严格的相对定量14常用定量方法——相对定量vs绝对定量•绝对定量•微生物检测：病毒拷贝数•转基因检测：转基因拷贝数•相对定量（差异）•基因表达差异16qPCR常用试验方法•绝对定量•标准曲线由已知浓度的RNA、质粒或合成的寡核苷酸链生成；•定量未知模板；•标准样品和未知样品必须同时反应；•相对定量•∆∆CTMethod：使用内参基因定量所研究样品和参照样品的目的基因；•参照样品基因与目的基因可以同时反应，也可以单独反应；•双标准曲线法：对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达；绝对定量由标准品计算未知样品的拷贝数利用管家基因校正并计算目的基因倍数关系相对定量一步法vs两步法qPCRqRT-PCR实验条件RNAOneStepRT-PCR(Onetube)TwoStepRT-PCR(Twotubes)AmpliconAmpliconcDNAGeneSpecificprimersOligodTRandomPrimers•可进行PCR或qPCR•需要基因特异性引物•高通量•使用同类的RNA(i.e.singlecell)•适合从大量的RNA样本中得到少量基因（数目）的信息•先进行cDNA合成再进行PCR•高效的第一链合成•可为下游实验提供cDNA•适合从少量的RNA样本中得到大量基因（数目）的信息根据试验情况进行选择21•qPCR技术•绝对定量VS相对定量•一步法VS两步法qRT-PCR概述•核酸提取•cDNA合成(两步法qRT-PCR)•引物设计方法和原则样品准备•必要的对照、内参、标准•选择相应的荧光检测方法•试剂选择实验设计•分析扩增曲线、溶解曲线和标准曲线•实验常见问题分析数据分析22核酸提取RNA提取•TransZolTransZolUp•TransZolPlantEasyPureRNAKit•EasyPureViralDNA/RNAKitEasyPurePlantRNAKit•EasyPureBloodRNAKitTransZolUpPlusRNAKit•EasyPuremiRNAKit好的qPCR结果来源于高质量的模板DNA提取•BloodZol•PlantZol•EasyPureGenomicDNAKit•EasyPurePlantGenomicDNAKit•EasyPureBloodGenomicDNAKit•EasyPureMarineGenomicDNAKit•EasyPureBacteriaDNAKit23cDNA合成(两步法qRT-PCR)好的qPCR结果依赖于成功的cDNA合成反转录•cDNA影响qPCR敏感度•全长cDNA合成增加qPCR成功率引物•Oligo(dT):只识别mRNA，合成cDNA序列靠近3’•随机引物:随机合成序列，可能合成非编码RNA，造成定量结果高估•两者混合结合两者优点24绝对定量和相对定量实验要求25绝对定量模板尽可能选择与目的基因序列相同以保证扩增效率相同来源质粒DNA纯化PCR产物ReferenceDNA(genomicDNA)精度每次加样要保证在2μl以上，减少误差梯度至少3个点，最好5个点26相对定量内参基因选择内参基因的作用检测样本材料中RNA是否降解纠正样本加样的差异校正cDNA合成速率差异校正PCR抑制剂的影响常用内参基因GAPDHβ-actin18SrRNA选择不同的物种选择不同的内参基因，有时候可选择组合内参基因。27引物设计方法和原则维基百科/google输入待查基因名称网络免费设计软件•Primer3（primer3.ut.ee）引物和双标记水解探针的设计Tm的计算•MFold（）引物和扩增产物二级结构的预测二级结构的稳定性(deltaG)和融解温度(Tm)•BLAST（）结构特异性30SYBR引物设计原则SYBR-Green引物引物长度18-30bps，产物长度范围100~400bpG/C含量:40-60%避免引物内含有互补序列(尤其是3’端)避免3’端错配3’端不能出现连续三个以上的G或C避免3’端出现T碱基设计跨内含子引物31TaqMan探针和引物设计TaqMan探针•Tm值比引物高10℃•没有连续相同的碱基•探针位置尽可能地靠近上游引物•C远远多于G•5‘端没有GTaqMan引物•Tm(58-60℃)•15-30basesinlength•G+C含量30-80%•不要有连续4个G•3’端不能有连续两个以上的G+C•5‘端不要有G(AorCpreferred)•引物之间的TM相差避免超过2℃•扩增长度50-150bp(max400)•引物跨越内含子32•qPCR技术•绝对定量VS相对定量•一步法VS两步法qRT-PCR概述•核酸提取•cDNA合成(两步法qRT-PCR)•引物设计方法和原则样品准备•必要的对照、内参、标准•选择相应的荧光检测方法•试剂选择实验设计•分析扩增曲线、溶解曲线和标准曲线•实验常见问题分析数据分析33对照设置34对照设置阴性对照–Negativecontrol:Notemplate(NTC)•Use:检验是否有模板污染–Noreversetranscriptase(NRT):•Use:检验RNA样品中是否有DNA污染–Noamplificationcontrol(NAC):•Use:检验是否有聚合酶污染–Noprobecontrol(NPC):•Use:检验荧光污染–Buffer:Onlycontainsbuffer•Use:检验背景荧光阳性对照–Calibrator:可以用带有PCR扩增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸；质粒DNA；克隆到质粒的cDNA；体外反转录的RNA；ReferenceRNApools；来自于特定的生物体样本的RNA或DNA及国际上公认的生物学标准物。–Standardcurve35定量方式选择36定量方式选择•SYBRGreen适用-特异性要求不是特别高的反应，分子数（拷贝数）超过1000的反应-探针实验前，进行预实验-PCR条件非常成熟，无二聚体，无非特异扩增•TaqMan适用-特异性要求较高的实验-多重PCR（标记不同的荧光基团）-SNP-灵敏度要求较高的实验标准曲线法和∆∆Ct法相对定量方法–基因表达差异–目的基因，内参基因•∆∆Ct–只依靠Ct值–用于大通量（很多基因，如芯片结果）–计算简单–估计性的结果–要求目的基因和内参基因扩增效率都比较好•双标准曲线法–结果精确–对扩增效率要求不高–构建目的基因与内参基因的标准品–相当于两个绝对定量–每次反应都要作标准曲线双标准曲线法双标准曲线法•用目的基因和内参基因的标准品分别获得标准曲线•处理与未处理样品同时扩增目的基因和内参基因，获得C(t)值•通过标准曲线计算目的基因和内参基因的绝对拷贝数•用内参基因对目的基因均一化•均一化之后的目的基因值相比得出处理与未处理的样本中目的基因的表达差异39实例分析相对定量实例实验目的：比较病毒刺激细胞后，细胞抗病毒基因ISG54的表达情况差异。样品：病毒刺激细胞，对照细胞试剂：TransZolUp、TransStartTopGreenqPCRSuperMix、TransScriptTMIIFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix其它材料：内参引物（GAPDH）目的基因引物（ISG54）对照样品及内参引物确定对照样本（Calibrator）多个样本比较情况下，其中之一作为对照样本，其它所有样本中目的基因的表达都相对于对照上调或下调。确定内参基因（GAPDH或β-actin）在所有样本中恒定表达的已知基因，该内参基因可以是一个或多个。内参基因一般是稳定表达的，但在个别物种中可能并非稳定表达，此时需选择多个内参引物。数据分析扩增曲线溶解曲线GAPDH内参基因扩增曲线溶解曲线ISG54目的基因数据分析数据分析△△Ct=△Ct(实验)—△Ct(对照)△Ct(实验)=Ct（实验，目的基因）—Ct（实验，内参基因）△Ct(对照)=Ct（对照，目的基因）—Ct（对照，内参基因）2－△△Ct=2－（－3.22）=9.32病毒刺激细胞后，细胞中的ISG54抗病毒基因表达上调了9.32倍。2－△△CtTemplateAssayCt(dRn)对照细胞GAPDH18.20病毒刺激细胞GAPDH18.22对照细胞ISG5426.84病毒刺激细胞ISG5423.64如何制作标准品•以Adeasy腺病毒质粒为例：一个质粒MW=36820bp×2×330=2.43×1072.43×107g/mol6.023×1023个分子/mol=4.03×10-17g一个质粒(1copy)的质量=拷贝数1031041051061071081091010标准质粒质量4.03x10-144.03x10-134.03x10-124.03x10-114.03x10-104.03x10-94.03x10-84.03x10-7-计算出拷贝数（copies/ul）-梯度稀释制作标准品（大体积稀释10μlto90μl）-定量PCR，检查C