18全国艾滋病检测技术规范要点

《全国艾滋病检测技术规范》要点中华医学会检验中心联系：13103221307一、特点概述1．《全国艾滋病检测技术规范（2004年版）》是参考国际标准ISO/DIS15189-2004、ISO/DIS15190-2004和GuidelinesforUsingHIVTestingTechnologiesinSurveillanceWHO/CDS/CSR/EDC/2001.16UNAIDS/01.22EISBN9713-92-063-7对〈全国艾滋病检测技术规范(试行)〉进行全面修订而成，与国际检测技术和策略紧密接轨。2.对原有章节的修改和完善：样品的采集和处理，HIV抗体的检测（目的、要点、方法及结果报告）,HIVP24抗原检测（方法、结果报告和解释），艾滋病检测实验室安全防护等。3.配合VCT(自愿咨询检测)和当前防治工作的需求，新增了以下内容:HIV抗体检测的替代策略，婴幼儿HIV感染诊断，HIVRNA定量测定（病毒载量测定），CD4+/CD8+T淋巴细胞检测，职业暴露预防和补充实验室意外事故紧急处理措施。4.按技术规范要求，对每章内容均标明了“范围”和“规范性引用文件”。一、对原有章节的修改和完善：1.样品的采集和处理（1）规定了样品的采集和处理适用范围：用于艾滋病病毒（HIV）检测的血清、血浆和全血样品的采集和处理方法，适用于HIV抗体检测、抗原检测、核酸检测、CD4+/CD8+T淋巴细胞测定和HIV分离培养。（2）应根据实验要求选用适当的抗凝剂：如CD4+/CD8+T淋巴细胞测定可选用K3EDTA或肝素或枸橼酸钠，HIV病毒分离、核酸定性/定量检测可选用K3EDTA或枸橼酸钠。（3）样品的保存用于CD4+/CD8+T淋巴细胞测定的样品不能长期保存，样品采集时间超过48h则不可检测。（4）样品的运送应采用WHO提出的三级包装系统：第一层容器：装样品，要求防渗漏。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。随样品应附有送检单，送检单应与样品分开放置。第二层容器：要求耐受性好、防渗漏、容纳并保护第一层容器，可以装若干个第一层容器。将试管装入专用带盖的容器内，容器的材料要易于消毒处理。第三层容器：放在一个运输用外层包装内，应易于消毒。在第三层容器外面要贴标签（数量，收、发件人）。（5）样品的接收打开标本容器时要小心，以防内容物泼溅。样品处理时若内容物有可能溅出，则应在生物安全柜中戴手套进行。同时应戴口罩、防护眼镜，以防皮肤或粘膜污染。如果污染过重或者认为样品不能被接受，则应将样品安全废弃。并要将样品情况立即通知送样人。2．HIV抗体的检测（1）HIV抗体的检测规定了HIV抗体的检测方法、检测程序、检测报告及检测策略；其适用范围为：各级各类医疗机构、疾病预防控制机构、检验检疫机构、采供血机构及卫生保健机构。可作为对HIV感染者/AIDS病人的诊断、报告和处理的实验室依据。并规定了规范性引用文件。（2）HIV抗体检测实验室应符合《全国艾滋病检测工作规范（1997年版）》中对检测实验室人员、建筑设施和设备等条件的要求。应符合《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2004）对II级生物安全实验室（BSL-2）的各项要求。（3）HIV抗体检测的目的和要点HIV抗体检测的目的：HIV抗体检测可用于监测、诊断、血液筛查。以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。HIV抗体检测的要点：筛查试验阳性不能出阳性报告。严格遵守实验室标准操作程序（SOP）。严格按照试剂盒说明书操作。注意防止样品间交叉污染。（4）HIV抗体检测的筛查方法常用的筛查方法是酶联免疫试验（ELISA）快速检测（RT）及其它检测随着对HIV感染者和AIDS病人抗逆转录病毒治疗的进展，及对无症状HIV感染者提供自愿咨询检测（VCT）的迫切需求，简便、快速的HIV检测方法被广泛应用。常用的主要有以下几种：①明胶颗粒凝集试验（PA）：PA是HIV血清抗体检测的一种简便方法，是将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有HIV抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA试剂有两种，HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA试剂（AFDHIV-1/2PA），已经我国食品药品监督管理局（SFDA）注册批准；HIV-1、HIV-2抗原分别致敏的PA试剂（SERODIA-HIV-1/2）可初步区分HIV-1型和HIV-2型，目前我国尚未引进。②斑点EIA（dot-EIA）：以硝酸纤维膜为载体，将HIV抗原滴在膜上成点状，即为固相抗原。加血清样品作用，以后步骤同ELISA。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10min以内，使用抗原量少。③斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验：与斑点EIA相似，也是以硝酸纤维膜为载体。区别在于不用酶标记抗体，而代之以红色的胶体金（或胶体硒）A蛋白，用渗滤（或层析）法作为洗涤方法。试剂稳定，可室温长期保存。试验时不需任何设备，迅速、简便、特异性较好，敏感性约相当于中度敏感的ELISA，适用于应急检测、门诊急诊个体检测。目前已有在国内被SFDA批准注册的国外进口试剂和国内产品。一般可在1030min内判读结果。④艾滋病唾液检测卡：在硝酸纤维膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同时检测含在唾液中的HIV-1/HIV-2抗体，原理为酶免疫间接法。主要检测唾液中的HIVIgA与IgG抗体，敏感性特异性与ELISA相近，可避免静脉穿刺。但样品预处理时间长且售价较高。以唾液为样品测定HIV抗体的ELISA、免疫印迹法（WB）试剂美国FDA已批准。⑤其它快速筛查试验方法：家庭HIV检测（HomeAccessSystem）等。尿液HIV抗体检测1996年美国FDA首次批准HIV-1尿液ELISA试剂，我国也正在研制尿液HIV抗体检测试剂。主要适用于静脉注射毒品（IDUs）人群和其它高危人群的大面积流行病学调查、监测。筛查阳性者仍需采血做确认试验才能确定。（5）HIV抗体筛查检测中初筛和复检试验的检测和报告方法根据检测目的选用符合要求的筛查试剂对样品进行初筛和重复检测（复检）。初筛试验：以第三代ELISA（双抗原夹心法）为例。备好试剂盒、待检样品和外部对照质控血清后，按试剂盒说明书以及质控和安全防护要求进行筛查检测。实验结果①阴性对照（NC），HIV-1阳性对照（PC1），HIV-2阳性对照（PC2）NC必须＜0.25方可用，排除NC≥0.25的值，计算NC平均值。NC界限范围：0.6倍NC均值＜NC＜1.4倍NC均值。②符合以下条件的实验成立：两个以上的NC可用（＜0.25）。PC1-NC均值≥0.4，PC2-NC均值≥0.4③Cutoff值=阴性对照均值+0.100小于Cutoff为阴性，大于或等于Cutoff为阳性4）报告：对HIV抗体筛查试验，呈阴性反应者可出具“HIV抗体阴性”报告（可用附表1）；对初筛试验呈阳性反应者不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复查”报告（附表1）。如需送上级实验室进行复测或确认，需要填写“HIV抗体复测送检单”（附表2），经1名检验人员和1名具有中级以上技术职称的人员审核签字。送当地艾滋病筛查中心实验室，再转送艾滋病确认实验室，或在本实验室复检后直接送确认实验室。复检试验：对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛查试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认。对筛查阴性和阳性者，均需做好检测后咨询。（6）HIV抗体确认试验结果报告确认试验由确认实验室根据检测结果出具“HIV抗体确认检测报告单”（附表3），报告HIV抗体阳性（+）、HIV抗体阴性（-）及HIV抗体不确定（±）。符合HIV-1抗体阳性判断标准，报告“HIV-1抗体阳性（+）”，并按规定做好检测后咨询、保密和疫情报告工作。符合HIV抗体阴性判断标准，报告“HIV抗体阴性（-）”。如果近期有高危行为，如性乱、注射毒品等，或有急性流感样症状等情况，为排除因“窗口期”而出现的假阴性结果，建议高危行为后3个月时再做抗体检测。也可进行HIV-1P24抗原或HIV核酸检测，作为辅助诊断。符合HIV抗体不确定判断标准，报告“HIV抗体不确定（±）”，在备注中应注明“3个月后复检”，同时进行以下处理：1)随访复检：每3个月随访复检1次，连续2次，共6个月。如果检测时暴露时间已超过3个月，则在3个月后随访1次即可。将前后2份样品同时检测，仍呈不确定或阴性则报告HIV抗体阴性，如果在随访期间发生带型进展，符合HIV抗体阳性判定标准则报告HIV-1或HIV-2抗体阳性。2)必要时可做HIV-1P24抗原或HIV核酸测定，但检测结果只能作为辅助诊断依据，确认报告要依据血清学随访结果。省艾滋病确认中心实验室难以确认的样品，送国家艾滋病参比实验室确认。同一受检对象的样品在不同实验室得到不一致的确认结果时，由国家艾滋病参比实验室和艾滋病确认实验室审评及技术指导专家组予以仲裁。3．HIVP24抗原的检测规定了P24抗原的检测方法、适用范围和规范性引用文件。（1）适用范围：HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断。HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断。第四代HIV-1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反应，但HIV-1抗体确认阴性者的辅助诊断。监测病程进展和抗病毒治疗效果。（2）HIVP24抗原检测方法P24抗原的检测通常是采用ELISA夹心法，已知抗体包被固相反应板孔底，加入待测血清，若血清中含有P24抗原则与包被抗体形成抗原-抗体复合物，再加入酶（HRP）标记的HIV-1抗体与抗原结合，加底物显色，在酶标仪上读结果。为了提高检测血清中P24抗原的敏感性，需先将血清中免疫复合物解离后再进行测定，目前已发展了ICDP24抗原（immun-complexdisassociate，免疫复合物解离，ICD）测定试剂，用于HIV-1P24抗原测定。即使将复合物解离，敏感性提高，也只能在大约50%无症状感染者中检出P24抗原。4）结果报告和解释HIV-1P24抗原的阳性结果必须经过中和试验确认，若阳性标本的OD值比中和反应前减少50%以上，才确定为HIVP24抗原结果阳性。HIV-1P24抗原阳性仅作为HIV感染窗口期的辅助诊断依据，不能据此确诊。HIV-1P24抗原检测的敏感性为3090％，低于病毒载量测定。HIV-1P24抗原阴性结果只表示在本试验中无反应，不能排除HIV感染。婴幼儿经过胎盘或哺乳从母亲获得的HIV抗体不能用于诊断是否经母婴传播感染HIV。婴幼儿体内从母亲得到的HIV抗体持续存在时间最长不超过18个月。在18月龄以前可以用多种不同的非抗体依赖性的检验方法对新生儿HIV感染进行辅助诊断，包括：HIVP24抗原检测、病毒分离培养、RNA或DNA测定。4．艾滋病检测实验室安全防护规规定了全国各级各类艾滋病实验室的安全防护，规范性引用文件（1）实验室生物安全级别1）艾滋病血清学检测艾滋病血清学检测（包括筛查和确认实验室）、免疫学和核酸检测应在符合Ⅱ级生物安全实验室（BSL-2）要求的艾滋病检测实验室中进行。2）HIV分离、研究HIV分离、细胞培养及研究工作应在Ⅲ级生物安全实验室（BSL-3）中进行。（2）实验室管理要求1）