任务1-4-1(2)谷氨酸发酵工艺

任务1-4-1谷氨酸发酵工艺1、工艺流程2、发酵工艺参数控制3、发酵异常现象及处理一、谷氨酸的生产工艺流程谷氨酸菌种的扩大培养•普遍采用二级种子培养流程:•即保藏菌种→斜面种子→摇瓶种子培养→种子罐→发酵罐•一级种子培养1000ml三角瓶中•二级种子培养种子发酵罐种子发酵罐斜面培养基组成：葡萄糖0.1％蛋白胨1.0％牛肉膏1.0％氯化钠0.5％琼脂2.0—2.5％pH7.0—7.2（传代和保藏斜面不加葡萄糖，为了利于菌体生长而不产酸）培养条件：7338、B9类菌种30—32℃，培养18—24h；T6—13类菌种33—34℃，培养18—24h。检查：培养完成后，要仔细观察菌苔生长情况，菌苔的颜色和边缘等特征是否正常，有无感染杂菌和噬菌体的征象。1、菌种斜面培养种子的扩大培养培养基：葡萄糖2.5％，尿素0.5％，硫酸镁0.04％，磷酸氢二钾0.1％，玉米浆2．5—3．5％(按质增减)硫酸亚铁、硫酸锰各2ppm，PH6.5—6.8(培养基成分可因菌种不同酌情增减)。培养条件：培养温度7338和B9类菌30一32℃、T6—13类菌种33—34℃，摇床上振荡培养12小时。2、一级种子培养一级种子质量要求种龄：12hpH值：6.4±0．1光密度：净增OD值0.5以上残糖：0.5％以下无菌检查：(一)噬菌体检查：无镜检:菌体生长均匀粗壮，排列和整齐革兰氏染色：阳性根据菌体生长情况，酌情增减生物素等用量，随时调整培养基组成。3、二级种子培养接种量O．8—1．0％培养温度32℃(T6—13菌为33—34℃)培养条件培养时间7—8h通风量50L种子罐1：0.5搅拌转速250L种子罐搅拌转速300500L种子罐搅拌转速340r／min1:0.3r／min1：0.25230r／min二级种子的质量要求种龄：7—8hpH：7．2左右OD值：净增0.5左右无菌检查：(一)噬菌体检查：无残糖：消耗1%左右镜检：生长旺盛，排列整齐革兰氏染色：阳性二、原料处理1、原料的来源谷氨酸发酵以糖蜜和淀粉为主要原料。糖蜜：是制糖工厂的副产物，分为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜两大类。淀粉：来自薯类、玉米、小麦、大米等也可使用醋酸、乙醇、正烷烃（液体石蜡）等2、原料及处理谷氨酸发酵以糖蜜和淀粉为主要原料。一糖蜜1糖蜜：是制糖工厂的副产物，分为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜两大类，其中含较多的可发酵性糖，总糖含量：甘蔗糖蜜54.8%，甜菜糖蜜49.4%；总糖中主要是可发酵性糖。目的：降低生物素的含量。方法：活性炭吸附法：用量为糖蜜的30%—40%水解活性碳处理法：盐酸+活性碳树脂处理法：3、糖蜜的处理(1)糖蜜中糖浓度高，必须进行稀释，一般稀释至18～20%。(2)糖蜜中杂质很多，如黑色素、灰分等，必须进行澄清、过滤。一般采用加酸静置，加酸调pH3.0～3.8，并定时通风，除溶液中的SO2、NO2等有害性挥发成分。(3)糖蜜中的含氮物质较少，应补充营养盐，如硫酸氨，磷酸钙等物质。(4)调pH7.0～7.5。(5)灭菌：80～90℃。3、糖蜜的处理4、淀粉的预处理淀粉的水解原料→粉碎→加水→液化→糖化→淀粉水解糖三、谷氨酸发酵的控制1温度的控制国内常用菌株的最适生长温度为30-34℃，产生谷氨酸的最适温度为34～36℃。0～12h的发酵前期，主要是长菌阶段；发酵12h后，菌体进入平衡期，增殖速度变得缓慢；温度提高到34～36℃，谷氨酸的生成量就增加。2pH的控制一般发酵前期pH控制在7.5-8.5左右，发酵中、后期pH控制在7.0～7.2，调低pH的目的在于提高与谷氨酸合成有关的酶的活力。谷氨酸发酵在中性和微碱性条件下可积累谷氨酸，而在酸性条件下则容易形成谷酰胺和N-乙酰谷酰胺。尿素被谷氨酸生产菌细胞的脲酶所分解放出氨，因而发酵液的pH会上升。发酵过程中，由于菌体不断利用氨，以及有机酸和谷氨酸等代谢产物进入发酵液，使N源不足和发酵液pH下降，需再次流加尿素。3溶解氧的控制谷氨酸产生菌是兼性好氧菌在实际生产中，搅拌转速固定不变，通常用调节通风量来改变供氧水平。原则：发酵前期，以低通风量为宜；发酵中、后期，以高通风量为好。通风比（m3/m3.min）：每分钟向1m3的发酵液中通入0.1cm3无菌空气，用1:0.1表示。4.流加糖控制流加时间流加速度流加量5种龄和种量的控制微生物的生长大致可分为适应期、对数期、稳定期、衰老期种龄：一级种子菌龄控制在11～12h，二级种子菌龄为7～8h。种量：指接入发酵罐内种子的量占发酵罐内发酵培养基量的百分比。接种量的多少对适应期的延续时间也有很大的影响。接种量一般以1％为好。种量过多，使菌体生长速度过快，菌体娇嫩，不强壮，提前衰老自溶，后期产酸不高；如果接种量过少，则菌体增长缓慢，会导致发酵时间延长，容易染菌。6OD值的控制OD值是细菌个数、菌体大小和发酵液色泽深浅的综合反应。以B9和T6-13菌株为例，当初糖为12.5％～14%时，长菌期的OD净增值在0.7～0.9。当细胞进入平衡期后，OD值已达到最大值，此时细胞数不再增加，但因为细胞个体还会继续伸长增大，所以OD值会略有上升。6OD值的控制生物素是谷氨酸生产菌不可缺少的生长因子。当培养基的生物素将被耗尽时，细菌就停止增殖。提高生物素的含量，OD值会上升，但一方面细胞的膜通透性会变差，影响谷氨酸从胞内往胞外渗出；另一方面，在高生物素环境下，菌体只进行增殖并不生成谷氨酸。因此，控制OD值的增长，是保证菌体在胞外大量蓄积谷氨酸的重要手段。7泡沫的控制生产上为了控制泡沫，除了在发酵罐内安装机械消泡器外，还在发酵时加入消泡剂。目前谷氨酸发酵常用的消泡剂有：花生油、豆油、玉米油、棉子油、泡敌和硅酮等。天然油脂类的消泡剂的用量较大，一般为发酵液的0.1%～0.2%(体积分数)，泡敌的用量为0.02%～0.03%(体积分数)。发酵罐四、发酵异常现象及处理1.污染杂菌和感染噬菌体引起的发酵异常（1）污染杂菌污染杂菌后，OD值增长快，糖耗也快，且发酵液泡沫增多，但谷氨酸生成量少。处理：如果发酵前期发现杂菌污染，可将培养基重新灭菌，并酌加培养基成分，重新接种后再发酵。如果发酵中期发现染菌，而pH、OD值和糖耗等尚属正常，此时可加大风量，按常规继续发酵。如果发酵后期染菌，一般对发酵影响不大。（2）感染噬菌体感染噬菌体后，OD值不上升甚至下跌，因此发酵液pH上升且变得粘稠，泡沫也增多。发酵液中很少有谷氨酸蓄积。处理：•如果发酵前期发现感染噬菌体，可将培养基重新灭菌，或采用并罐法。•如果发酵中期发现感染噬菌体，将培养基在70℃加热10min杀死噬菌体，补料补种，重新发酵。•如果发酵后期染菌，一般对发酵影响不大。2.种子质量差引起的发酵异常将种龄过长或活力弱的种子接入发酵罐后，在发酵中、后期，糖耗就变得缓慢，pH不下降、波动不活跃，谷氨酸生成量少。处理：停止搅拌或减小通风量，追加生物素、磷盐和镁盐。3.培养基配比差错引起的发酵异常（1）生物素生物素是谷氨酸生产菌不可缺少的生长因子。生物素不足，长菌慢，糖耗慢，菌体生长不足。生物素过量，葡萄糖的消耗被用于菌体增殖。生物素（2）磷盐。磷在微生物细胞中含量较高，它是合成核酸、核蛋白、磷脂、各种核苷酸和辅酶的重要元素。如果培养基中不加或少加磷酸盐，则菌体生长缓慢，糖耗慢，最终菌体生长不足。如磷盐过多，糖的降解都通过EMP和TCA，菌体增殖快。4.发酵条件控制不当引起的发酵异常通风量发酵前期通风量不足，影响不大；中后期供氧不足，则谷氨酸生成少。温度发酵前期、中期温度过高，细胞易衰老；温度过低，发酵周期长。pH发酵终点判断发酵终点：残糖在1%以下且糖耗缓慢（0.15%）或残糖0.5%。达到放罐标准后，及时放罐