兼性厌氧产蛋白酶菌株的筛选及其发酵豆粕工艺研究ashx

分类号：密级：UDC：学号：405604811113南昌大学专业学位研究生学位论文兼性厌氧产蛋白酶菌株的筛选及其发酵豆粕工艺研究Screeningofprotease-producingbacteriuminfacultativeanaerobicconditionsandstudyonitsapplicationforfermentingsoybeanmeal唐晓星培养单位（院、系）：生命科学与食品工程学院食品科学与工程系指导教师姓名、职称：熊涛教授专业学位种类：学术硕士专业领域名称：食品科学论文答辩日期：2014年5月答辩委员会主席：评阅人：2014年5月29日学位论文独创性声明一、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名（手写）：签字日期：年月日二、学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权北京万方数据股份有限公司和中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务，同意按“章程”规定享受相关权益。学位论文作者签名（手写）：导师签名（手写）：签字日期：年月日签字日期：年月日论文题目姓名学号论文级别博士□硕士□院/系/所专业联系电话E_mail通信地址(邮编)：备注：□公开□保密（向校学位办申请获批准为“保密”，年月后公开）摘要I摘要本论文以兼性厌氧、产蛋白酶为条件，筛选发酵豆粕优良菌种；对筛选菌株进行毒理性实验和蛋白酶相对酶活力的测定，并结合实验室保藏的植物乳杆菌NCU116对豆粕发酵技术进行研究，跟踪分析发酵过程，确定最佳发酵工艺条件。本文的主要研究内容与结论如下：（1）优良发酵豆粕菌种的筛选与鉴定。在发酵豆粕、自然发酵的豆豉中筛选得到1株兼性厌氧、产蛋白酶菌株。经生理生化实验、分子生物学实验，确定其为甲基营养型芽孢杆菌，并命名为NCU507。（2）甲基营养型芽孢杆菌NCU507(BacillusmethylotrophicusNCU507)的毒理性研究。首先对甲基营养型芽孢杆菌NCU507生长曲线的进行测定，0~8h，NCU507菌数迅速增加至9.1×107cfu/mL(7.96logCFU/mL)；8h~20h,菌数缓慢增加，在20h时达到最大，为4.8×108cfu/mL(8.68logCFU/mL)；之后，菌数缓慢减少，40h时减少至1.8×107cfu/mL(7.26logCFU/mL)。然后，测定NCU507的细胞毒性，发现其在106cfu/mL和107cfu/mL时的加入量不会引起Caco-2细胞膜结构的破坏，无细胞毒性。（3）甲基营养型芽孢杆菌NCU507(BacillusmethylotrophicusNCU507)的酶学性质研究。在不同的温度、pH、保温时间等因素的限制下测定蛋白酶的相对酶活力。结果表明，在40℃、pH为7.0时相对酶活力和酶的稳定性最高，Mn2+对酶反应促进作用最为明显。（4）甲基营养型芽孢杆菌NCU507(BacillusmethylotrophicusNCU507)单菌发酵豆粕工艺研究。单因素实验表明最佳发酵时间为96h、最佳发酵温度为37℃、最佳接种量为4%、最佳料水比为1:1。.响应面实验优化结果表明最佳发酵温度36.8℃，最佳料水比为1:1.2，最佳发酵时间为85h；在此条件下，理论可预测的水解度为26.24%。根据理论预测条件进行验证实验，结果显示其水解度为26.13%，与预测值接近，表明实验优化所得工艺条件可靠。对单菌发酵豆粕过程动态分析，在前48h内，菌数维持在大约8.85logCFU/g；随着时间的增加，甲基营养型芽孢杆菌NCU507的菌数逐渐下降。终点96h时，下降至6.66logCFU/g。总蛋白的含量逐渐上升。0h时，初始总蛋白含摘要II量为47.68%（w/w），终点96h时，总蛋白含量增加至52.90%（w/w）。小肽含量持续增加。在0h~36h内，小肽的含量迅速增加，由0.30%增加至21.40%（w/w），之后在36h~96h内，小肽的含量缓慢增加，终点96h时，达到28.13%（w/w）。有机酸含量呈逐渐减少趋势，在0h~24h内，有机酸含量维持在0.49%（w/w），接着在24h~72h内迅速下降，在72h时，有机酸含量降至0.15%（w/w）；在72h~96h内，有机酸含量持续下降并逐渐降低至0%（w/w）。（5）甲基营养型芽孢杆菌NCU507(BacillusmethylotrophicusNCU507)与植物乳杆菌NCU116混菌固态发酵豆粕工艺研究。单因素实验表明，NCU116与NCU507最佳接种比例为1:4、最佳总接种量为9%、最佳发酵时间为96h、最佳料水比比例为1:1。响应面优化结果表明，最佳接种比例为5:1、最佳总接种量为7.50%、最佳料水比为1:1.2。此优化结果，理论可预测的水解度为26.52%。根据理论预测条件进行验证实验，结果显示其水解度的为26.37%，与预测值接近，表明实验优化所得工艺条件可靠。对混菌发酵豆粕过程动态分析，植物乳杆菌NCU116的加入使得甲基营养型芽孢杆菌NCU507菌数的稳定期从48h缩短为24h，0h~24h时，NCU507的菌数维持在9.58logCFU/g左右，然后在24h~96h内，迅速下降至4.72logCFU/g；NCU116的菌数的稳定期时间较长，在0h~48h时一直维持在8.83logCFU/g，然后在48h~96h内，下降至6.00logCFU/g。总蛋白含量逐渐上升，终点96h时，总蛋白含量为57.08%（w/w）。与单菌发酵相比，混菌发酵实验总蛋白含量上升了4.18%（w/w）；小肽含量在整个发酵过程中呈上升趋势，终点96h时，豆粕中小肽含量达到26.78%（w/w），与单菌发酵相比，数值偏低。有机酸含量呈先上升，后下降，再稳定的趋势，且与单菌发酵相比，有机酸含量在整个发酵过程中维持较高水平。关键词：发酵豆粕；甲基营养型芽孢杆菌；兼性厌氧；总蛋白含量；小肽含量ABSTRACTIIIABSTRACTInordertoimprovethequalityoffermentedsoybeanmeal(SBM),onebacterialstrainthatproducedproteasebothunderanaerobicandaerobicconditionswasisolatedandidentifiedasBacillusmethylotrophicusNCU507.However,thefermentedSBMproducedanunpleasantflavorwhichcouldberelievedbyco-fermentationwithLactobacillusplantarumNCU116.Inthecomparisonofmonoxeniefermentationandmixedfermentation,thepresenceofL.plantarumNCU116ledtoashorterstabletimeofNCU507(from48hto24h).Inaddition,crudeproteincontentandtitratableacidityofmixedfermentationwerehigherthanthoseofmonoxeniefermentation.Thispaperconductedthefollowingstudies:(1)ResearchontechnologyofbreedingspecialbacteriafermentedSBM.Protein-richsampleslikefermentedblankbeanandfermentedsoybeanwerecollectedforisolationofbacterialstrains.Theyweresuspended,dilutedandplatedoncaseinmedium.Microorganismsshowingtransparentcycleinbothaerobicandanaerobicenvironmentswerepickedupfor16SrRNAanalysis.Theobtained16SrRNAgenesequencewasblastedanddepositedingenbank.Phylogenetictrees(NJ)wereconstructedbyMEGA5.2.Basedon16SrRNAsequenceanalysis,NCU507showed100%identitytoB.methylotrophicus(EU194897).Meanwhile,NCU507wasfoundtoshowtheshortestdistancewithB.methylotrophicus(EU194897)inphylogenetictree(NJ).ItwasthusdeterminedasB.methylotrophicusNCU507.(2)CytotoxicityassayofB.methylotrophicusNCU507.Firstly,thegrowthcurveofB.methylotrophicusNCU507wasmeasured.In0~8h,thenumbersofB.meth--ylotrophicusNCU507increasedrapidlyto9.1×107,thenin8~20h,thenumberswereincreasedslowlyandreachedto4.8×108;At40h,thenuberswerereducedanddownedto1.8×107.Then,B.methylotrophicusNCU507(108cfu/mL、107cfu/mLand106cfu/mL)wereappliedonCaco-2monolayersfor24handthecytotoxicitywasevaluatedbymeasurementofLDHreleaseandmicroscopicobservation.TheresultshowthattheamountofLDHreleaseinthesupernatantofABSTRACTIVCaco-2culturedintheabsenceorpresenceofthebacteriawasunchanged,indicatingthatB.methylotrophicusNCU507didn’tcausecelllysis.(3)TheoptimalconditionsforproteaseactivityandstabilitywaspH7.0and40℃,theenzymicactivitywasactivatedbyMn2+(4).ResearchonB.methylotrophicusNCU507solidstatefermentationofsoybeanmeal.Onthebasisofsingle-factorexperiments,theoptimizationofferm--entationtimewas96h,temperaturewas37℃，inoculumwas4%and